加州鲈病原菌耐药性试验和用药建议

朱士文，徐玉龙，潘秀莲，陈笑冰，孙作登

（1.山东省淡水渔业研究院，山东 济南 250013；2.聊城市茌平区水产渔业技术推广服务中心，山东 聊城 252100；3.山东省渔业发展和资源养护总站，山东 济南 250013）

抗生素作为防治水生动物细菌病的首选药物，在加州鲈细菌性疾病的防治中广泛应用。但随着抗生素的长期大量使用，其缺点也逐渐暴露出来，如易产生耐药性问题，甚至出现了多重耐药现象，导致药物治疗失败，造成经济损失，同时也危害人类食品安全。准确把握病原菌耐药性，可以提高施药针对性和精准度，有效减少抗生素类药物滥用乱用现象，切实推进水产养殖用药减量增效，促进渔业健康绿色发展。

根据农业农村部“动物疫情监控与防治（渔业）——病原菌耐药性普查”工作安排，在山东省聊城市加州鲈主产区2个重点养殖场采集样品，分离病原菌，测定菌株耐药性，在此基础上提出了精准施药建议，为促进加州鲈养殖业绿色健康持续发展提供了数据支撑。

1 材料与方法

1.1 供试菌株的分离鉴定

加州鲈采样点设2处，采样点1为山东泰丰鸿基农业科技开发有限公司，采样点2为茌平润生养殖专业合作社。2021年5—10月，从加州鲈采样点尽量采集具有典型症状的病鱼试验样品，无病症时采集健康鱼例行检验，每月每个采样点各采集样品4尾，累计采样6次，共计48尾。用75%乙醇棉球擦拭鱼体后，用灭菌剪刀于肛门前端剪入，分离内脏器官，选取腹水以及心、肝、肾、脾等组织或器官，用灭菌双蒸水清洗表面后，划线接种于NA培养基平板上，培养温度为28～35℃。24～28 h后观察菌落生长情况，挑取优势单菌落划线提纯培养。纯化后的菌落，一份用于药敏试验，一份寄至上海海洋大学测序鉴定，同时甘油保种备用。

1.2 供试药物

1.3 供试菌株最小抑菌浓度的测定

挑取纯化后的单菌落,制备成0.5麦氏单位浓度的菌悬液；在阴性和阳性对照孔中，分别加入无菌生理盐水和0.005麦氏单位浓度的标准大肠埃希菌悬液各200μL；96孔药敏微孔板中加入0.005麦氏单位浓度的病原菌菌悬液200μL；持平微孔板，轻微摇晃使之均匀，于（28±1）℃培养，24～28 h后观察并记录菌株生长情况，以抑制菌株生长的最高稀释度作为该菌株测试药物的最小抑菌浓度（MIC）。

1.4 数据统计方法

根据美国临床实验室标准化研究所（CLSI）发布的药物敏感性及耐药性标准，对菌株耐药性进行判别，判别标准如下。

（1）恩诺沙星：敏感，ρ（MIC）≤0.5 mg/L；耐药，ρ（MIC）≥4 mg/L。

（2）盐酸多西环素、氟甲喹：敏感，ρ（MIC）≤4 mg/L；中敏，ρ（MIC）=8 mg/L；耐药，ρ（MIC）≥16 mg/L。

（3）氟苯尼考、甲砜霉素、硫酸新霉素：敏感，ρ（MIC）≤2 mg/L；中敏，ρ（MIC）=4 mg/L；耐药，ρ（MIC）≥8 mg/L。

（5）磺胺间甲氧嘧啶钠：敏感，ρ（MIC）≤256 mg/L；耐药，ρ（MIC）≥512 mg/L。

应用SPSS软件，统计各供试菌株试验结果。本试验MIC为抑制90%受试菌株生长所需的最小抑菌浓度，菌株耐药率计算公式如下：

式中：S为菌株耐药率，%；N为耐药菌株数量，个；N为菌株总数，个。

2 结果与分析

2.1 养殖场病害、药物使用及损失情况

5—10月，采样单位发病率低于1%。发病加州鲈体表多为点状出血、溃疡、肠炎等，解剖后，鲈花肝、肠道空。发现患病个体立即捞出隔离，死亡个体采用无害化处理方法，定期施用微生态制剂作为预防性用药。全年未发生因病致损的情况。

2.2 病原菌分离鉴定结果

累计采集48尾加州鲈，共分离纯化出病原菌13株（表1），其中维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）4株（30.77%）；弧菌（Vibrio）3株，包括创伤弧菌（Vibrio vulnificus）2株（15.38%）和纳瓦拉弧菌（Vibrio navarrensis）1株（7.69%）；希瓦氏菌（Shewanella）2株（15.38%）；金色微菌（Chryseomicrobium）1株（7.69%）；柠檬酸杆菌（Citrobacter）1株（7.69%）；沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）1株（7.69%）；深海微小杆菌（Exiguobacterium profundum）1株（7.69%）。

表1 加州鲈采样及病原菌情况

2.3 菌株对抗菌药物的感受性

表2 病原菌对各抗菌药物的感受性分布（n=13）

表3 维氏气单胞菌对各抗菌药物的感受性分布（n=4）

2.4 菌株耐药率

根据各菌株对药物的耐受性结果，以CLSI相关标准为判定依据，对分离菌株的耐药性进行统计。

表4 弧菌属菌株对各抗菌药物的感受性分布（n=3）

图1 菌株对抗菌药物的耐药性

3 用药建议

由试验结果可知，加州鲈所有致病菌株对硫酸新霉素均为敏感或中敏，该水产用抗菌药可以作为周边地区常见和新发细菌性疾病的首选备用药物。但硫酸新霉素药饵进入肠道后不被吸收，多用于肠道疾病治疗。养殖中，可用恩诺沙星或盐酸多西环素治疗由气单胞菌引起的细菌性败血症等疾病，用恩诺沙星或氟苯尼考治疗由弧菌引起的体表溃疡性疾病。此外，建议日常定期使用三黄散、维生素C等保肝护肝药物拌料投喂加州鲈，以预防养殖疾病；定期施用微生态制剂调节水质，如发生病害可根据试验结果用药。

上述数据局限于山东地区的2个采样点，尽管分离到的菌株有一定的耐药率，但不能代表山东地区的整体情况，应广泛采集养殖区域样本以进行深入研究。