集美大学海洋食品与生物工程学院的杨汝晴、陈玉磊、曹敏杰*等以鲈鱼为研究对象，探讨其在4 ℃冷藏条件下理化性质、质构、MMPs活力等指标的变化，利用免疫组织化学技术分析冷藏过程中I型胶原蛋白的变化，旨在为了解鲈鱼在冷藏条件下的品质变化机理提供一定的理论参考。

1、鲈鱼冷藏过程中肌肉理化性质变化

如图1A所示，鲈鱼肌肉的初始pH值为7.01，在贮藏初期，由于糖原和ATP的分解，pH值逐步降低至6.82。随贮藏时间的延长，蛋白质分解产生碱性含氮物质，从而导致pH值升高，贮藏至第12天，鲈鱼肌肉pH值为7.43。TVB-N含量被广泛用于评价鱼类的新鲜度，大多数新鲜海洋鱼类的可接受TVB-N含量限度为30 mg/100 g。本研究结果显示，TVB-N含量在鲈鱼4 ℃贮藏4 d后明显增加，并在第8天超过限值（图1B）。挥发性碱性化合物主要由腐败微生物代谢蛋白质产生，因此菌落总数是评价鱼肉质量的重要指标。鲜鱼可接受的菌落总数临界值为6.0（lg（CFU/g））。通常，冷藏一段时间的鱼肉仍可保持其新鲜度，但是低温不能完全抑制微生物的生长。新鲜鱼肉的初始菌落总数为3.33（lg（CFU/g）），随着贮藏时间的延长，第6天和第8天时菌落总数分别达到5.47（lg（CFU/g））和6.35（lg（CFU/g））（图1C），第8天超过临界值。K值是反映鱼肉新鲜度的重要生化指标，K值越低新鲜度越高。如图1D所示，新鲜鲈鱼的K值为6.76%，随冷藏时间延长K值逐渐增加，在第8天达67.71%，超过60%的可接受值。通过对鲈鱼冷藏期间的TVB-N含量、菌落总数以及K值等指标进行综合评价，得出4 ℃冷藏条件下，鲈鱼的最佳贮藏期为8 d以内。

2、鲈鱼冷藏过程中肌肉总蛋白SDS-PAGE分析结果

如图2A所示，在贮藏6 d以内，鲈鱼肌肉中的肌球蛋白重链（myosin heavy chain，MHC）和肌动蛋白没有发生明显变化。随贮藏时间进一步延长，MHC逐渐降解为150 kDa左右，但肌动蛋白未发生明显降解。光密度值分析结果显示，在贮藏6 d以内，MHC降解比例为10%以下，而当贮藏时间至第8天时，约32%的MHC发生降解，至第12天时降解比例达50%。肌动蛋白在整个贮藏过程中降解均不明显（图2B）。因此，低温贮藏前期鲈鱼肌肉蛋白组成基本稳定，贮藏后期MHC发生明显降解。

3、鲈鱼冷藏过程中肌肉组织形态的变化

由图3可知，Masson染色法较好地区分了肌原纤维和胶原纤维，其中肌原纤维呈红色，而胶原纤维呈蓝色。贮藏初期（0～2 d），鲈鱼背部肌肉纤维排列紧密，结构完整，纤维间隙均匀（图3A、B）；贮藏至第6天，细胞间隙增大，肌内膜变细，肌纤维变得疏松（图3C）；贮藏至第12天，包裹肌纤维的肌膜降解，肌纤维明显断裂，组织结构变得模糊（图3D）。

4、I型胶原蛋白的免疫组化分析结果

由图4可知，鱼肉中I型胶原主要存在于肌纤维缝隙的肌内膜和包裹着肌纤维的肌膜。肌内膜提供强大抗拉功能并呈现一定规律的网状结构，肌膜对肌纤维结构的完整性起支撑作用且呈现有序的平行排列。在新鲜状态下（0 d），结缔组织中的肌内膜显色明显，包裹肌纤维的肌膜略有显色（图4A）。贮藏至第2天，肌膜显色逐渐清晰，可能是肌膜与肌纤维开始解离，胶原蛋白更多外露，与抗体反应的比表面积增加从而导致颜色加深。当冷藏至第6天，肌膜显色进一步加深，表明肌膜与肌纤维间的紧密结合程度减弱（图4C）。当贮藏至第12天，肌膜与肌纤维发生明显分离，肌纤维的紧密结构被破坏（图4D）。因此，冷藏期间鱼肉结缔组织中的I型胶原蛋白发生了明显分解。

5、鲈鱼冷藏过程中肌肉硬度和MMPs活力的变化

如图5所示，贮藏初期，鲈鱼肌肉硬度呈现先上升后下降趋势，贮藏2 d后，随着贮藏时间的延长而逐渐降低。研究发现，蛋白酶对胶原蛋白的降解与鱼肉弹性的下降密切相关，因此鱼肉中内源性蛋白酶被认为是导致鱼肉变软的重要原因。其中，MMPs主要参与胞外基质的降解与重塑，能够分解鱼体肌肉中不同类型的胶原蛋白。采用荧光肽底物对贮藏期间鲈鱼肌肉中MMPs活力进行分析，结果如图5所示。在新鲜状态下能检测到MMPs活力，冷藏期间MMPs活力持续增强，12 d约为初始酶活力的2 倍。正常生理条件下，MMPs以酶原的形式分泌到胞外，并通过激活途径产生有活性的酶，参与胞外基质的降解与重塑。鲈鱼在4 ℃贮藏过程中，无活性的MMPs酶原被激活产生更多活性酶，从而参与鱼死后肌肉软化过程。

结论

本实验通过对4 ℃冷藏过程中鲈鱼肌肉pH值、TVB-N含量、菌落总数、K值、质构、MMPs活力等指标测定，发现鲈鱼品质在第8天超过临界值。尽管贮藏8 d后鲈鱼肌肉蛋白中肌原纤维蛋白MHC开始降解，但肌肉结缔组织中I型胶原的降解是导致肌肉软化的主要原因，而MMPs是降解I型胶原的主要酶类。