人工雌核生殖技术及其在鱼类育种中的应用

符文，彭亮跃，肖亚梅*

（1.湖南师范大学生命科学学院，省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室，长沙 410081；2.湖南师范大学化学生物学及中药分析教育部重点实验室，长沙 410081）

雌核生殖（gynogenesis）是指卵子只依靠雌性原核进行发育的一种特殊的生殖方式。20世纪初，Hertwig最先在蛙胚胎中发现了雌核生殖的现象。鱼类中一些自然群体几乎由雌性组成，如亚马逊花鳉（Poeciliaformosa）、墨西哥莫氏鳉（Poeciliamexicana）、银 鲫（Carassiusauratus gibelio）、彭泽鲫（Carassiusauratus）等，研究证实这些天然全雌群体以天然雌核生殖的方式繁殖。天然雌核生殖鱼类的配子形成机制相当复杂，天然雌核生殖鱼类卵子发育基本上不发生第1次成熟分裂或者成熟分裂后不排出第2极体，并且胚胎第1次卵裂为核内有丝分裂等来维持其倍性。此外，天然雌核生殖鱼类卵子在近缘种甚至远缘种精子的激活下启动发育，但并未发生雌、雄原核的融合，精子只起激活作用，后代均为母系遗传，形成单性的雌性群体。

在天然雌核生殖研究基础上，人们探索鱼类人工诱导雌核生殖技术。目前，人工雌核生殖已经发展成为鱼类遗传改良的有效途径，在鱼类种质提纯复壮、良种选育等方面发挥重要作用。本文结合鱼类育种发展实践，系统地对鱼类人工雌核生殖的技术途径、研究现状和应用进行总结，并提出了鱼类人工雌核生殖存在的问题及展望，以期为鱼类人工雌核生殖技术未来的发展提供参考。

1 人工雌核生殖中精子的选择及其遗传灭活

对于两性生殖动物而言，新个体的生命始于精卵融合，即受精过程。受精不仅将双亲遗传物质传递给子代，而且通过精子激活卵子并启动新个体发育。因此，人工诱导雌核生殖仍然需要“受精”过程。

1.1 精子的选择

在人工诱导雌核生殖过程中，可以选用同源或者异源精子来激活卵子发育。同源精子激活主要应用于海水鱼，有研究使用同源精子诱导雌核生殖半舌滑鳎（Cynoglossussemilaevis）；Peruzzi等也使用同源精子诱导雌核生殖欧洲鲈（Dicentrarchuslabrax）。但在精子遗传灭活过程中，部分同源精子遗传灭活不彻底，导致正常受精发育而来的自交个体隐藏于雌核生殖群体中，后续难以鉴定雌核发育二倍体与普通二倍体，因此研究者们寻求亲缘关系较远的异种精子诱导雌核发育，特别是远缘杂交难以产生存活后代的异源精子，这样可确保存活的后代为雌核生殖。异源精子诱导雌核生殖的方法在鱼类人工雌核生殖研究中已被广泛应用。Chen等使用遗传灭活的岩鲷精子诱导雌核生殖黄鼓鱼（Nibeaalbiflora，Sciaenidae）；Saber等使用遗传灭活的西伯利亚鲟精子诱导雌核生殖裸腹鲟（Acipenser nudiventris）；另外，在淡水鱼中使用异源精子成功获得了雌核生殖草鱼（Ctenopharyngodonidella）、翘嘴鲌（Culteralburnus）、团头鲂（Megalobrama amblycephala）等。

研究表明，在异源精子诱导雌核生殖过程中，会出现少量父本遗传物质整合到雌核生殖后代的现象。Chen等在异育银鲫的基因组中发现了稳定插入的父系DNA片段；有学者在雌核生殖草鱼中发现了父本锦鲤来源的DNA片段；Gong等在2种异源精子诱导的雌核生殖团头鲂中，均检测到父本的DNA片段。这些父源DNA片段不仅可作为鉴别雌核生殖二倍体和普通二倍体有效的分子标记，而且这种异源的遗传效应可使得雌核生殖后代获得生长更快、抗逆性更强等优良性状。

1.2 精子的遗传灭活

精子的遗传灭活是人工诱导雌核生殖的关键，目前主要采用化学方法和物理方法。

化学方法是指使用化学药物处理使精子遗传物质失活。常用的化学药物有乙烯脲（ethyleneurea）、吖啶黄（trypalflavine）、甲苯胺蓝（toloniumchloride）、二甲基硫酸盐（dimethylsulfate）和甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate）等，但化学药物处理后，精子的生理活性很弱，诱导效果不理想。

目前鱼类人工诱导雌核生殖中广泛采用物理方法使精子遗传灭活，如X射线、γ射线和紫外线照射。在辐射育种发展早期，多用X射线和γ射线处理精子。Yousefian等用X射线和γ射线处理精子诱导鲤鱼雌核生殖；Onozato用γ射线处理精子诱导大马哈鱼（Oncorhynchusketa）雌核生殖；Ijiri用 γ 射线处理精子诱导青鳉（Oryzias latipes）雌核生殖。X射线和γ射线的作用主要是诱发染色体断裂，它们具有较强的穿透力，便于大量精子处理，但对设备要求严格、操作复杂且具有一定的危险性。紫外线照射是目前使用最为广泛的精子遗传灭活方法。紫外线的主要作用是破坏精子头部的DNA结构，经紫外线照射后的DNA氢键断裂，同一链上相邻的或双螺旋相对应的两条链上的胸腺嘧啶之间形成胸腺嘧啶二聚体（thymine dimers），导致DNA结构变形，影响DNA复制和转录。相比于X射线和γ射线，紫外线照射设备简单、操作方便而且安全性更高。虽然紫外线的穿透力不强，但只需在处理过程中调整精液稀释倍数、照射距离和照射时间就可达到理想的遗传灭活效果。

2 人工雌核生殖中染色体加倍方法

鱼类的成熟卵子具备全部的个体发育潜能，但由于单倍体综合症（hapolid syndrom），单倍体胚胎在孵化期或者孵化后陆续死亡。因此，用遗传灭活精子授精后获得的“受精卵”还需通过人工处理使得单倍体（haploid）胚胎的染色体加倍并发育成二倍体（diploid）。

2.1 化学方法诱导染色体加倍

化学方法是指通过化学药剂处理诱导染色体加倍的方法。常用的化学药物如秋水仙素（colchicine）、细胞松弛素（cytochalasin）、6-二甲氨基嘌呤（6-dimethylaminopurine，6-DMAP）等。吴清江等研究显示，在人工诱导鲤鱼雌核生殖过程中，在受精后发育至2细胞期时，以25×10-6～100×10-6g·L-1的秋水仙素溶液浸泡30min，可获得31.6%二倍体雌核生殖个体。Refstie用质量浓度为1 μg·mL-1的细胞松弛素B溶液处理虹鳟（Oncorhynchusmykiss）30 h左右，成功获得了部分多倍体以及多倍体嵌合体。虽然化学药物在鱼类染色体加倍诱导中具有显著效果，但是具有较大的毒性，操作要求较为严格，会对子代个体的活性造成负面影响，而且在鱼类中往往会产生较多的嵌合体。因此，在鱼类雌核生殖诱导中化学方法使用较少。

2.2 物理方法诱导染色体加倍

纺锤体微管对温度和静水压敏感，通过破坏纺锤体的结构，导致正常的细胞分裂无法进行，可以实现染色体加倍。在人工诱导鱼类雌核生殖二倍体中主要采用温度休克和静水压休克2种物理方法。

温度休克是在高于（热休克）或低于（冷休克）最适发育温度的环境下，抑制受精卵第2极体的释放或第1次有丝分裂导致染色体加倍后。该方法设备简单、操作方便、可大批量处理，目前应用较为广泛。例如，Bencsik等利用热休克诱导雌核生殖虹鳟，于27.5℃热休克受精卵10 min后，可获得73.33%的雌核生殖后代；Zhang等［20］利用冷休克诱导雌核生殖二倍体草鱼，通过设置梯度起始休克时间，在4～6℃下处理10～12min，诱导获得了雌核生殖草鱼。目前温度休克方法在虹鳟、草鱼、团头鲂、牙鲆（Paralichthysolivaceus）等几十种经济鱼类中成功诱导获得了雌核生殖二倍体。温度休克诱导实践表明，一般冷水性鱼类更适合使用热休克诱导，温水性鱼类热、冷休克都可以诱导染色体加倍，而热水性鱼类则更适合使用冷休克诱导。

静水压法是一种对受精卵损伤小、孵化率较高的染色体加倍的物理诱导方法。Lou等用静水压法诱导雌核生殖二倍体虹鳟；Ghigliotti等用静水压法处理大西洋鳕鱼（Gadusmorhua）“受精卵”，最终获得了88.89%的雌核生殖二倍体。但静水压法需要专业的设备、操作复杂、处理量较小，成本相对较高。

2.3 减数分裂雌核生殖和有丝分裂雌核生殖

减数分裂雌核生殖（meiotic gynogenesis）指通过抑制第2次减数分裂诱导雌核生殖；而有丝分裂雌核生殖（mitotic gynogenesis）则指通过抑制第1次有丝分裂诱导雌核生殖。Morgan等在牙鲆人工诱导雌核生殖研究中，对受精后1～3 min的受精卵静水压休克6 min，诱导获得了减数分裂雌核生殖牙鲆；Zhang等在受精1～30 min内，每隔1～2 min取1次胚胎进行4～6°C冷休克，诱导获得了减数分裂雌核生殖和有丝分裂雌核生殖两种类型的雌核生殖二倍体草鱼；有学者在人工诱导雌核生殖黄鳝（Monopterusalbus）的研究中发现，胚胎在受精后70 min开始进入第1次卵裂前期，在受精后125 min完成第1次卵裂，在受精后100 min进行热休克处理时可获得100%的有丝分裂雌核生殖二倍体。有丝分裂雌核生殖获得的后代各基因座（locus）均处于纯合状态，有害隐性基因控制的性状就会表达出来，因此有丝分裂雌核生殖的诱导率和存活率相对较低。

3 远缘杂交获得雌核生殖后代

远缘杂交（distant hybridization）是指不同物种或更高分类的亲本之间的杂交，具有更大的产生新种质甚至新物种的潜力。有研究团队通过长期鱼类远缘杂交实践结果证实，远缘杂交是获得雌核生殖后代的一种有效途径：在红鲫（♀）与团头鲂（♂）的远缘杂交F1后代中出现了雌核生殖二倍体鲫；鲤（♀）与团头鲂（♂）的杂交F1代中分别形成了76.50%的雌核生殖二倍体鲤和17.50%的雌核生殖二倍体镜鲤［48］；草鱼（♀）与翘嘴鲌（♂）的杂交F1后代中出现了雌核生殖二倍体草鱼和三倍体草鲌。

4 人工雌核生殖技术在鱼类中的应用

早在1976年，通过人工雌核生殖的方法成功获得了生长速度快、抗病能力强的雌核生殖草鱼。随后，研究者们陆续在大马哈鱼、舌齿鲈、鲫和团头鲂等重要经济鱼类中通过人工雌核生殖获得了性状优良新品系。

4.1 快速建立纯系

在传统的鱼类育种中，建立遗传纯系一般要经过8～10代的连续选育才能获得纯系。雌核生殖后代的遗传物质完全来源于母本，有丝分裂雌核生殖获得的后代各基因座处于纯合状态，通过该方法只需1～2代就可获得纯系。如利用人工雌核生殖技术，在F1代快速获得了纯合转基因斑马鱼；李志等利用基因编辑结合人工雌核生殖技术，建立了一种高效创制黄河鲶基因突变体的方法，在F0代即可获得纯合基因编辑个体，大大缩短了纯系筛选周期。

4.2 获得鱼类新种质

虽然精子被遗传灭活处理，但异精诱导的雌核生殖后代中仍被证明有父本遗传物质的插入。Yi等和Zhao等的研究表明，人工诱导雌核生殖后代往往表现出一些明显来自异源精子供体的表型，这些父本遗传物质的存在可使雌核生殖后代获得优良性状；Zhang等使用遗传灭活的异源四倍体鲫鲤精子诱导获得了生长快速、抗病能力强的雌核生殖草鱼，并以雌核生殖草鱼为母本，普通草鱼为父本，大批量制备了生长速度快、抗病能力强的优良苗种；Gong等使用遗传灭活的锦鲤精子诱导获得了耐低氧能力更强的雌核生殖团头鲂。

4.3 全雌育种

在鱼类中，常常存在性别二态性，即一种性别比另一种性别生长快、个体大、成熟早等。在雌性为优势性别的鱼中，通过培育全雌的苗种进行养殖，可以大大提高生产效率，增加经济效益。全雌鱼可以通过雌核生殖技术直接制备，如雌核生殖草鱼、团头鲂、虹鳟等，但是受操作限制，人工雌核生殖后代数量有限。结合人工雌核生殖和性逆转技术，将性逆转的伪雄鱼与雌核生殖后代交配，可大规模制备全雌苗种。如Luo等使用性激素诱导雌鱼性逆转为伪雄鱼，再与雌核生殖鲫鱼交配，大规模制备了全雌鲫鱼苗种；中国水产科学研究院通过对人工诱导雌核生殖牙鲆进行性逆转，再与雌核生殖牙鲆交配，选育出了全雌牙鲆“北鲆1号”，该新品种比普通牙鲆生长快约20%，规格整齐，具有较好的经济效益。

4.4 性别决定机制的鉴定

性染色体决定性别的方式主要有ZW型和XY型。ZW型中，雌性（ZW）属于异配性别、雄性（ZZ）属于同配性别；XY型中，雌性（XX）属于同配性别、雄性（XY）属于同配性别。雌核生殖后代中，其性别决定完全由卵子的遗传物质控制，对雌性配子异型（ZW）的鱼来说，若WW型后代存活，那么雌核生殖后代的雌雄比为1∶1，若WW型后代不能存活，那么雌核生殖后代的为全雄。如大副泥鳅（Paramisgurnusdabryanus）和半舌滑鳎等的性别决定方式被证明为ZW型，它们雌核生殖后代中雄性比例较高；而对雌性配子同型（XX）的鱼来说，雌核生殖后代全部为雌性，如草鱼、团头鲂等的性别决定方式被证明为 XY型，它们的雌核生殖后代全部为雌性。

4.5 濒危鱼类保护

目前，自然环境破坏和人为过度开发，造成鱼类资源退化和物种濒危。雌核生殖技术是种质改良和遗传复壮的有效途径之一。对于濒危鱼类来说，可使用近缘物种的精子诱导人工雌核发育，实现濒危物种保护。如裸腹鲟没有发现野生个体自然繁殖，2011年已经被世界自然保护联盟（IUCN）列为极度濒危物种。2014年 Saber等［18］报道，使用遗传灭活的西伯利亚鲟精子启动裸腹鲟卵子发育，并在受精后10 min、2.5℃冷休克30 min，诱导获得了人工雌核生殖裸腹鲟。该方法为人工恢复濒危鱼类种群提供了参考。

5 鱼类人工雌核生殖存在的问题及展望

目前，尽管人工雌核生殖已经在鱼类育种实践中取得成功，但雌核生殖后代的成活率依然低下。温度休克对卵子损伤程度较大，处理参数设置不当容易导致胚胎成活率低。温度休克和静水压休克也会引起细胞器不稳定或解体，如中心体。中心体解体，不能形成纺锤，从而导致细胞分裂无法正常进行。刘少军等发明了一种雌、雄核发育新型实验设备，该设备操作方便、对精子紫外照射均匀，可减少外界环境对实验效果的影响，为精子遗传灭活参数优化提供了便利，同时也为高效规模化的开展人工雌核生殖操作提供了仪器设施的支持。

异源精子诱导的人工雌核生殖后代中异源遗传物质直接影响雌核生殖后代性状，但父本遗传物质与母本基因组整合的遗传机制尚不清楚，有待进一步深入研究。同时人工异源诱导雌核生殖后代商品化生产和大规模环境释放，其整合的异源遗传物质通过有性交配基因漂移逃逸到野生种及其野生近缘种中，容易造成野生种质污染。人工异源诱导雌核生殖鱼存在潜在的生态风险，可结合诱导三倍体不育系来防止逃逸到自然水体中污染野生种质资源。