罗氏沼虾头部“白点病”的诊断

发表时间:2024/10/23 18:12:30  来源:水产科技情报 2022年5期  作者:王文雁 王建刚 王元  浏览次数:212  
西南渔业网-丰祥渔业网秉承:求是务实不误导不夸大不炒作!水产专业网站为您提供优质服务!【郑重提醒】:本站所有文章,如需转载请注明出处,否则谢绝转载!!谢谢合~
市场在变,我们的诚信永远不会变!

罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)又名马来西亚大虾、淡水长臂大虾,是许多亚洲国家和地区重要的水产经济虾类。在我国,罗氏沼虾最初由中国农业科学院引进试养[1],因其具有生长速度快、抗病力强、口感好、个头大、耐运输、国内外市场需求量大等优点,现已在各地广泛养殖。上海位处长江口,具备优质的咸淡水资源,适合多种虾、蟹的繁殖和增养殖。上海市奉贤区水产技术推广站于1987年便开展了罗氏沼虾养殖试验并取得成功[2]。随后,金山区也开展了罗氏沼虾虾苗繁育技术研究,之后逐步发展壮大,现已是我国长三角地区罗氏沼虾亲虾及虾苗的重要供应基地之一。

近年来,病毒性疾病对水产养殖业发展的影响很大,已造成许多重大经济损失,对虾类健康养殖的威胁程度也日趋严重。现已发现多种侵染罗氏沼虾的病毒,如双顺反子病毒、诺达病毒、虹彩病毒、黄头病毒、肝胰腺细小病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒等[3-5]。其中,虹彩病毒是一种胞浆型的双链DNA病毒。目前国际病毒分类委员会将虹彩病毒科细分为6个属:蛙病毒属(Ranavirus)、淋巴囊肿病毒属(Lymphocystivirus)、肿大细胞虹彩病毒属(Megalocytivirus)、绿虹彩病毒属(Chloriridovirus)、虹彩病毒属(Iridovirus)和十足目虹彩病毒属(Decapodiridovirus)。十足目虹彩病毒是近年发现的一个新属,感染罗氏沼虾的虹彩病毒(DIV1)即为该属成员。

罗氏沼虾“白点病”最初发现于我国广东珠三角养殖区,随后在福建漳州养殖区也有零星出现,近两年在江都、高邮、兴化等江苏的主养地呈暴发态势,危害严重。近年来,在上海郊区养殖的罗氏沼虾也出现了头部“白点病”,造成大量沼虾死亡。通过对上海地区患“白点病”罗氏沼虾的组织病理及超微病理进行分析,并对其病原进行分子鉴定,确定该病为虹彩病毒(DIV1)导致。本研究首次在上海养殖区发现此病,应当引起养殖户关注,加强防范,避免造成较大的经济损失。

1 材料和方法

1.1 样品来源及前处理

罗氏沼虾病虾样本采集于上海市奉贤区某水产养殖场。养殖池为大棚覆盖的淡水池塘,水温为17~20 ℃。切取病虾的造血组织和健康虾的造血组织,各分成3份:一部分放入预装有戴维森氏AFA(Davidson’s AFA)固定液的样品瓶中,常温固定24 h;另一部分再细切成体积大小为1~2 mm3的组织块后放入预装有2.5%戊二醛固定液的离心管中,4 ℃固定24 h;剩余部分放入预装有无水乙醇的离心管中,常温保存。以上述3种方式处理的组织分别用于组织病理、超微病理和分子检测。

1.2 普通组织病理检查

按常规的石蜡组织切片程序处理用Davidson’s AFA液固定的组织块。组织块经脱水、透明、包埋、切片、脱蜡、复水后,使用苏木精和伊红(H&E)对切片进行染色,Leica DM4B 显微镜成像及分析。

1.3 超微组织病理检查

将2.5%戊二醛固定液固定的小组织块用0.1 M磷酸盐(PBS)缓冲液(pH=7.2)清洗,并在1% OsO4(锇酸)中后固定2 h,再次漂洗组织,并经梯度乙醇逐级脱水。脱水后,将样品包埋在环氧树脂812中,60 ℃聚合48 h。用徕卡超薄切片机切片,厚度为60~70 nm,铜网收片,乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色。最后使用FEI Tecnai G2 Spirit透射电子显微镜观察细胞病理变化。

1.4 总DNA提取

将乙醇固定的样品组织用超纯水漂洗3次,去掉残留乙醇后,按照天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒的说明进行操作。所有DNA样品用TE缓冲液洗脱,并于-20 ℃保存备用。

1.5 病毒基因检测

参考全国水产技术推广总站推荐的PCR方法——《虾虹彩病毒病诊断规程》(SC/T 7237—2020)。引物DIV1-F1(5’-GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT-3’)和DIV1-R1(5’-TCGTTTCGGTACGAAGATGTA-3’)用于扩增虹彩病毒(DIV1)的ATP酶基因,由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

PCR扩增25 μL体系:PremixTaq酶12.5 μL,正、反向引物各1 μL,DNA模板1 μL,灭菌双蒸水9.5 μL。PCR反应条件:95 ℃初始变性3 min;然后95 ℃变性30 s、59 ℃退火30 s和72 ℃ 延伸30 s,共35 个循环;最后72 ℃延伸5 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,于紫外光源下观察分析。取阳性PCR产物5 μL送测序,所得核酸序列经修剪头尾的不可靠碱基后,输入美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库进行BLAST检索比对,确定病原序列是否与目标病原一致。

2 结果

2.1 病虾的临床症状

在养殖过程中发现,罗氏沼虾突然停止进食,很少在水面游动。停饲后2~10 d,死亡率可达100%。尤其使用氯类制剂对发病塘进行水体消毒后会导致沼虾死亡加剧。病虾大多“偷死”在池塘的深水区,少数匍匐在池边浅水处,活力明显减弱,反应迟缓,濒死个体失去游动能力。病虾体略微发红,空肠、空胃,体表明显症状是额剑基部的造血组织颜色变白(见图1),因此被养殖户称为“白头病”或“白点病”。无论是单养罗氏沼虾的池塘,还是与南美白对虾或日本沼虾混养的池塘,均有“白点病”发生。此病具有传染性,呈现区域性发病的特点,通常1口塘发病后,周围几口养殖塘甚至区域内其他养殖户的养殖塘也会陆续发病。

图1 自然发病罗氏沼虾的头部白点症状

2.2 组织病理

组织病理检查显示,病虾造血组织出现了明显的病理变化:组织液增多和大量细胞坏死(见图2-a),部分区域呈现局灶性坏死(见图2-b)。坏死细胞的细胞质中出现异常的嗜碱性包涵体,其细胞核呈现固缩现象(图2-c~d),细胞失去原有的结构特征。

a.被感染的造血组织含有大量坏死细胞;b.造血组织的局灶性坏死;c.造血细胞的变性和坏死,白色箭头示坏死细胞中的核固缩,黑色箭头示嗜碱性包涵体;d.健康的造血组织,白色箭头示正常的细胞核。图2 患病罗氏沼虾造血组织的病理变化

2.3 超微病理

超薄切片透射电镜结果显示,病虾的造血组织中出现大量虹彩病毒,部分区域的病毒颗粒聚集,呈晶格状排列,多数病毒颗粒呈分散状分布在组织细胞中。造血细胞的细胞质中及细胞外基质中均可观察到病毒粒子,在细胞核中未发现病毒粒子。成熟病毒粒子由正六边形的衣壳和近似圆形的核心两部分构成,衣壳电子密度较低,核心的电子密度较高。病毒颗粒整体呈二十面体对称结构,直径为(153±8)nm,其核心直径为(91±5)nm。未成熟的病毒粒子仅有衣壳而无核心结构,呈空心状(见图3)。

a.大量虹彩病毒颗粒分布在造血组织中,N表示细胞核;b.*表示造血细胞内的虹彩病毒复制和组装区域;c.释放到细胞外基质中虹彩病毒颗粒;d.成熟的虹彩病毒颗粒具有近似正六边形的衣壳和电子致密的核心。图3 患病罗氏沼虾造血组织的超微病理变化

2.4 分子检测

凝胶电泳结果显示,病虾样品均扩增出与阳性对照大小一致的目标片段(见图4),而健康沼虾无目的条带。BLAST检索结果表明,所有阳性片段测序获得的基因序列与虹彩病毒(Genbank No.KY681040)序列一致性均达99%以上,因此确定该病毒为十足目虹彩病毒DIV1。

注:M表示DNA maker,条带自上而下大小依次为2 000 bp、1 000 bp、750 bp、500 bp、200 bp。1~7为患病罗氏沼虾,阴性对照为健康罗氏沼虾,空白对照所用模板为水,阳性对照为黄海水产研究所提供的阳性核酸。图4 患病罗氏沼虾虹彩病毒的PCR检测

3 讨论

3.1 造血组织变白是现场诊断DIV1感染的重要依据

病原体突破宿主免疫防线,侵入特定组织或器官进行大量增殖,并严重破坏机体正常的细胞组织结构和功能,从而导致靶组织、器官或机体表现出明显的异常信号,这些临床上肉眼可见的症状信号是病因诊断的重要依据。本研究通过电镜观察发现,DIV1具有虹彩病毒典型的二十面体结构,其主要侵染罗氏沼虾造血细胞的细胞质,未发现细胞核被感染的情况。DIV1在细胞质中大量增殖,并形成了较为透明的病毒发生基质,即H&E组织病理切片中被异常染色的包涵体结构,这与Qiu等[6]观察到的病理结果相似。此外,组织病理还发现,由于大量感染DIV1,因此病虾造血组织中出现大量的组织液及局部坏死病灶,这很可能是造血组织在临床症状上呈现不透明白色的原因。而且,据现有的虾类疾病研究报道,此症状为DIV1感染罗氏沼虾所特有,其他病原感染尚未发现此现象[7-9]。因此,水产兽医或养殖户在塘口进行疾病诊断时,可利用这一特点进行初诊。

3.2 虹彩病毒的流行及危害

DIV1易感宿主范围广泛,主要集中在十足目的虾类,包括罗氏沼虾、凡纳滨对虾、斑节对虾、脊尾白虾、日本沼虾、红螯螯虾和克氏原螯虾等[6]。有研究证实,三疣梭子蟹、中华绒螯蟹、粗腿厚纹蟹也是DIV1的易感宿主[10-11],但目前尚未有蟹类自然感染的报道。流行病学调查显示,该病毒在我国主要虾类养殖地区均有检出,如广东、福建、浙江、江苏、安徽、上海、山东、河北、天津等,流行分布非常广泛。因此给我国罗氏沼虾养殖生产的生物安保工作带来了巨大挑战。

甲壳动物对自身机体的免疫保护主要依靠血细胞来完成,血细胞随血液循环系统分布于全身各处,警戒着体外多种类型病原的入侵,如细菌、病毒、真菌、寄生虫等。血细胞会根据入侵病原类型和数量的不同,采取不同的免疫防御策略,如细胞吞噬、细胞结节、包囊等[12]。由于血细胞不能分裂,它们的更新补充须由血细胞的生产工厂——造血组织来实现。而DIV1首选靶组织是造血组织,当造血组织被病毒攻击后,机体免疫防御机能会被彻底破坏,易导致宿主快速死亡,因此DIV1的危害性非常大。

3.3 虹彩病毒的防控措施建议

罗氏沼虾“白点病”暴发的原因及其病原传播方式尚不清楚,能否垂直传播尚无证据。但根据本单位近几年的病原监测数据,DIV1在苗期已有检出,因此养殖户在购买罗氏沼虾虾苗时,应严格筛选不携带DIV1的苗种进行养殖生产。目前,为增加经济收益,混养模式已成为我国多数养殖地区的主流模式。在疾病防控工作中需特别注意,当混养近缘性的甲壳动物,如南美白对虾、罗氏沼虾、青虾和克氏原螯虾等虾类时,因这些品种均为DIV1的易感宿主,在引进苗种前同样需加强对DIV1的检测,以降低病原传入的风险。此外,罗氏沼虾与南美白对虾混养时,经常发现南美白对虾早于罗氏沼虾“偷死”。因此,当南美白对虾出现病症时,应及早检测、确诊,以便及时采取相应的措施,减少损失。

水温与虹彩病毒病的暴发存在一定的相关性。孙世玉等[13]发现,当水温保持在30 ℃以上,即使对虾携带有虹彩病毒也可正常生长,但转入低温环境则会引发疾病。本案例中,罗氏沼虾“白点病”的发病季节是秋季,水温17~20 ℃,处于高温转低温的阶段,与上述结论基本相符。因此,养殖生产中需注意水温的变化,尤其是携带病毒且尚未发病的池塘,可采取加温保温的措施,以防止水温降低而导致疾病暴发。

罗氏沼虾“白点病”发病速度快,传染性高,死亡率高,发病后很难挽救,因此重点在于预防。对有发病史的池塘应严格消毒清塘,防止二次感染。养殖过程中应及时了解周围其他养殖户是否有发病情况,尽可能避免因引进外塘水源或其他交叉感染因素而导致疾病传播。还可采取常用的预防病毒病措施——鱼虾生态混养,用凶猛性鱼类减少或消灭弱虾、病虾。此外,采取加强池塘底部增氧、泼洒益生菌等措施,可以避免条件致病菌大量生长繁殖,调控水质,减少发病概率。在降温期可通过增加水深、加强大棚保温、采取人工加温等措施来降低环境突变的影响。一旦发现感染DIV1,应及时做好发病池塘的管理,防止塘间传播,养殖废水不可任意排放,避免扩大传播区域。发病期间不宜使用刺激性大的消毒剂或纤毛虫类杀虫剂进行消杀,减少养殖虾的应激死亡。

声明:转载文是出于传递更多信息之目的。若有标注错误或侵犯了您的合法权益,请与本网联系,我们将及时更正、删除,谢谢
“养鱼第一线”微信公众订阅号

"养鱼第一线"微信公众帐号和养鱼第一线刘文俊视频号将会定期向你推送本号信息将为你精诚服务!

查看评论[0]文章评论