水产常见消毒剂对鱼源柱状黄杆菌的抑菌和杀菌效果研究

刘丽娟，王亚军，石存斌，王 庆，张德锋

(1.天津农学院水产学院，天津 300380；2.中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业农村部渔药创制重点实验室，广东省水产动物免疫技术重点实验室，广东 广州 510380)

柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)广泛分布于淡水水体、土壤等自然环境中，而且具有滑动能力和团聚性等特征，能够感染多种养殖鱼，是一种全球性的重要鱼类细菌性病原。柱状黄杆菌为条件致病菌，由该菌引起的鱼类柱形病在我国广泛流行，可造成被感染鱼出现烂鳃、体表溃疡等症状，体表病灶白色至黄色糜烂，严重时可引起全身感染。目前，鱼类柱形病的防治主要依赖于抗生素和消毒剂等化学药物，然而随着我国加强了对水产养殖用投入品的监管以及建立了水产养殖用投入品使用白名单，越来越多的抗生素被限制使用，尚有一些消毒剂可以使用。在实际水产养殖中，化学类消毒剂的应用可有效抑制或杀灭病原菌，起到防治细菌性疾病的效果，增加养殖经济效益。不同消毒剂的作用机制存在较大差异，筛选和开发具有高稳定性和抗菌效果优良的消毒剂，对于防控鱼类柱形病具有重要的现实意义。本研究通过分析常见水产消毒剂对鱼类柱状黄杆菌的抑菌和杀菌效果，以期为鱼类柱形病的科学防控提供依据，促进水产养殖的健康可持续发展。

一、材料与方法

1.实验菌株与消毒剂

柱状黄杆菌Fc001、Fc2020、MR2017、YY2017、Ms1907a、Ms2008、Ci0901、Ci2015、Ci2007a、Ps01、Fla120602、GHS061212、Hn2101和GY2001，共14株，分离自2008-2021年患病鱼的鳃部，并进行了菌种鉴定和保藏，其中柱状黄杆菌YY2017、MR2017、Fc2020由天津市水产研究所惠赠。

消毒剂：二氧化氯①、二氧化氯②、二氧化氯③、三氯异氰尿酸①、三氯异氰尿酸②、溴氯海因、二溴海因、苯扎溴铵溶液、戊二醛-苯扎溴铵、聚维酮碘、复合碘、硫醚沙星①、硫醚沙星②、硫醚沙星③、浓戊二醛、滥申停、蛋氨酸碘、过氧化钙、过硫酸氢钾购自不同的水产消毒剂生产厂家。

2.实验方法

(1)消毒剂的制备。将19种消毒剂母液或粉末分别用纯水稀释成8 192毫克/升的工作液，然后通过0.22微米的滤器进行过滤除菌。

(2)Shieh液体培养基的制备。称取蛋白胨5克、酵母提取物0.5克、硫酸镁0.3克、牛肉膏0.2克、磷酸氢二钾0.1克、氯化钡0.01克、醋酸钠0.01克、碳酸氢钠0.05克、磷酸二氢钾0.05克、氯化钙0.006 7克、硫酸铁0.001克，加入1 000毫升蒸馏水中，pH调至7.2，121℃下灭菌25分钟。

(3)病原菌的培养及菌悬液制备。将14株柱状黄杆菌接种于Shieh固体培养基进行活化，28℃培养箱静置培养24小时后，接种于Shieh液体培养基，28℃摇床振荡培养24小时，取1.5毫升新鲜菌液离心获得菌体，使用无菌PBS重悬，调整菌液浓度为1×107CFU/毫升。

(4)消毒剂对柱状黄杆菌的最小抑菌浓度(MIC)测定。首先每孔加50微升的Shieh液体培养基，消毒剂采用二倍稀释法，在96孔板上进行系列梯度稀释，每列消毒剂的含量依次为2 048、1 024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1毫克/升。然后接种50微升的菌液，使其终浓度为5×106CFU/毫升。阳性对照组为只加菌液、不加消毒剂，阴性对照组为只加消毒剂、不加菌液。28℃静置培养36小时后观察结果，实验重复3次。因柱状黄杆菌培养液不易通过肉眼观察判断菌液是否明显变浑浊，因此通过酶标仪测定其OD600是否有显著变化用于确定每种消毒剂对柱状黄杆菌的MIC。当阳性对照为有细菌生长(培养基变浑浊)、阴性对照无细菌生长(培养基清亮)，实验组中无菌生长的最低消毒剂浓度即为该消毒剂对柱状黄杆菌的MIC。

(5)消毒剂对柱状黄杆菌的最小杀菌浓度(MBC)测定。根据上述MIC实验结果，选取MIC之前5个孔中的培养液各100微升，均匀涂布于Shieh固体纯化培养基上，置于28℃的恒温培养箱培养36小时，观察是否有菌落出现。在Shieh固体平板上无菌落生长的最低消毒剂浓度即为该消毒剂对柱状黄杆菌的MBC。

二、结果与分析

1.消毒剂对柱状黄杆菌的MIC

由实验结果可知，阳性对照OD600均有明显变化，表明细菌生长良好；阴性对照OD600无明显变化，表明无菌生长(培养基和操作过程中没有细菌污染)。不同消毒剂对鱼源柱状黄杆菌的MIC(表1)不同。苯扎溴铵对柱状黄杆菌的抑菌效果最好，其MIC为2～4毫克/升；其次为戊二醛-苯扎溴铵、滥申停(主要成分为戊二醛-苯扎溴铵)，MIC均为16～32毫克/升；二氧化氯①、二氧化氯②、蛋氨酸碘和过氧化钙对柱状黄杆菌的抑菌效果一般，其MIC分别为64～128毫克/升、64～512毫克/升、64～128毫克/升和128～512毫克/升；二氧化氯③、三氯异氰尿酸①、溴氯海因、硫醚沙星②对柱状黄杆菌的抑菌效果不理想，仅对部分菌株有抑菌效果，对大部分菌株抑菌浓度在1 024毫克/升以上；三氯异氰尿酸②、二溴海因、聚维酮碘、复合碘、硫醚沙星①、硫醚沙星③、浓戊二醛、过硫酸氢钠对柱状黄杆菌的抑菌效果较差，其MIC超过2 048毫克/升。

以上19种消毒剂的MIC实验结果表明：苯扎溴铵和戊二醛-苯扎溴铵混合制剂在较低浓度下可以有效抑制柱状黄杆菌生长，抑菌效果显著。三氯异氰尿酸②、二溴海因、聚维酮碘、复合碘、硫醚沙星和浓戊二醛对柱状黄杆菌的抑菌效果较差。

2.消毒剂对柱状黄杆菌的MBC

MBC即为供试药物杀灭99.9%或以上受试菌所需要的最低浓度。不同消毒剂对鱼源柱状黄杆菌的MBC(表2)不同。实验结果显示：苯扎溴铵对柱状黄杆菌的杀菌效果最好，其MBC为2～4毫克/升；戊二醛-苯扎溴铵、滥申停的杀菌效果次之，MBC均为16～32毫克/升；二氧化氯①、二氧化氯②、蛋氨酸碘和过氧化钙对柱状黄杆菌的抑菌效果一般，其MBC分别为64～256毫克/升、64～512毫克/升、64～256毫克/升和128～512毫克/升；二氧化氯③、三氯异氰尿酸①、溴氯海因、硫醚沙星②、三氯异氰尿酸②、二溴海因、聚维酮碘、复合碘、硫醚沙星①、硫醚沙星③、浓戊二醛和过硫酸氢钾对柱状黄杆菌的杀菌效果较差，对绝大部分菌株MBC超过了1 024毫克/升，甚至超过2 048毫克/升。综上可知，苯扎溴铵对柱状黄杆菌的杀菌效果最好。

三、讨论

本研究选取当前市场上常见的水产消毒剂，通过抑菌和杀菌实验筛选高效的消毒剂，为有效控制养殖水体中的柱状黄杆菌，科学指导用药，及时采取有效措施控制病情，减少由柱状黄杆菌引起的鱼类柱形病提供参考依据，对实现水产经济动物健康养殖、保障食品安全具有重要意义。

表1 不同消毒剂对柱状黄杆菌的MIC 毫克/升

表2 不同消毒剂对柱状黄杆菌的MBC 毫克/升

柱状黄杆菌分离平板 柱状黄杆菌纯培养菌落形态

分析19种常用消毒剂对14株不同鱼源柱状黄杆菌进行抑菌、杀菌效果，MIC实验结果表明：苯扎溴铵对柱状黄杆菌的抑菌效果最好；戊二醛-苯扎溴铵、滥申停效果次之；氯制剂、碘制剂、溴氯海因和硫醚沙星等抑菌效果一般；戊二醛、过硫酸氢钾等药物对柱状黄杆菌的抑菌效果较差。MBC实验结果表明：苯扎溴铵对柱状黄杆菌的杀菌效果最好；戊二醛-苯扎溴铵、滥申停(主要成分为戊二醛-苯扎溴铵)效果次之；氯制剂、碘制剂和过氧化钙的杀菌效果一般；硫醚沙星、戊二醛和过硫酸氢钾等药物的杀菌效果较差。

苯扎溴铵、戊二醛-苯扎溴铵和滥申停等消毒剂对柱状黄杆菌具有较好的抑菌、杀菌效果，但是浓戊二醛对柱状黄杆菌的抑菌效果较差，表明戊二醛-苯扎溴铵和滥申停等消毒剂中主要起抑菌和杀菌作用的是苯扎溴铵。本研究表明苯扎溴铵在较低浓度下可以有效抑制和杀灭柱状黄杆菌，其效果明显优于其他消毒剂。本研究还进行了同种类型消毒剂的横向比较，结果表明不同来源的同类消毒剂，其抑菌和杀菌效果有一定的差异，因此，在选用消毒剂时应注意甄别不同产品的优劣，应选择具有较好疗效的消毒剂产品。本研究表明不同鱼源柱状黄杆菌对同类消毒剂的药物敏感性存在一定的差异，这提示养殖业者应加强鱼源柱状黄杆菌的药物敏感性监测，提高用药的精准度。本研究为水产养殖过程中精准使用消毒剂用于科学防控柱形病提供了参考依据。

本研究在减少水产品药物的使用量，强化渔药的合理、规范使用，以及提升水产品质量具有重要意义。然而，在实际养殖过程中，应动态监测鱼类病害，确定其主要致病菌，并及时分析病原菌的药物敏感性，根据不同养殖品种、水质条件和天气变化，制定规范、科学、合理的用药技术方案，实现鱼类柱形病的精准防控，促进水产品质量安全。