虎杖提取物对尼罗罗非鱼脂肪肝的干预作用

马良骁，贾 睿

(1.湖北至正天辰生物科技有限公司，武汉 430070；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心， 江苏无锡 214081)

近年来，随着水产养殖规模化、集约化程度提高，鱼类肝脏疾病频繁发生，如肝胆综合征、化学性肝损伤以及脂肪性肝损伤，严重制约着鱼类健康养殖发展[1,2]。其中，以脂肪肝或脂肪性肝损伤为主要特征的肝脏疾病越来越受到研究者和生产者的关注。鱼类脂肪性肝病与肝脏脂肪代谢紊乱、氧化应激、炎症反应以及肝细胞坏死有关[3,4]。水产养殖中，营养过剩、环境应激、病原菌感染、基因突变等均可导致脂肪肝的发生[5]。脂肪肝的危害主要包括降低生长、饲料利用率、免疫力、应激耐受性和产品感官等，对水产养殖业和市场消费者造成相当大的负面影响[6]。

虎杖(Polygonumcuspidatum)为蓼科植物，为我国传统中药，其根茎含有多种药理活性成分，如蒽醌类、二苯乙烯类、萘醌类、黄酮类等[7-9]。早期研究表明，虎杖提取物可有效抑制小鼠(Musmusculus)肝组织中甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)沉积，改善脂肪代谢[10]。除此之外，虎杖提取物还可提高小鼠抗氧化能力、抑制炎症因子生成、缓解四氯化碳引起的肝损伤[11]。杜金梁等[12]研究发现虎杖提取物能有效提高鲤(Cyprinuscarpio)肝细胞抗氧化能力，抑制肝细胞损伤。但关于虎杖提取物对鱼类脂肪肝病干预方面的研究还未见报道。本研究以尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)为研究对象，用高脂饲料诱导建立脂肪性肝损伤模型，同时在饲料中添加虎杖提取物，探究其对尼罗罗非鱼脂肪肝的干预作用，为鱼类保肝饲料添加剂的开发提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验鱼

实验用鱼取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心渔场，体质健康，无伤，规格基本一致。实验开始前，将尼罗罗非鱼暂养于循环水养殖系统中(水温：(30±3) ℃；pH 6.8～7.6；溶解氧>6 mg/L；总氨氮<0.1 mg/L；亚硝酸盐<0.1 mg/L，每天换水10%)进行驯化，以适应实验环境，并以3%体重的基础饲料饲喂，每日两次，连续14 d。

1.2 试剂

虎杖提取物(10 ∶1)购自于西安汇林生物科技有限公司；实验所用的麻醉剂和磷酸盐缓冲液购自于Sigma Company (St.Louis，MO，USA)。

1.3 试验设计

将尼罗罗非鱼随机分为4组，正常组：饲喂基础饲料(6%粗脂肪)；高脂组：饲喂高脂饲料(21%粗脂肪)；2.5 g/kg虎杖提取物处理组：饲喂含2.5 g/kg虎杖提取物的高脂饲料；5 g/kg虎杖提取物处理组：饲喂含5 g/kg虎杖提取物的高脂饲料。每组设3个重复，每个重复30尾鱼。饲养60 d后，对所有鱼称重。然后每组随机选取12尾鱼，采集血液和肝组织。血液样品通过离心(5 000 r/min，10 min)分离血清，储存于-80 ℃备用。

1.4 生化指标测定

甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛(MDA) 等生化指标均按照相应的试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行测定。

1.5 基因表达检测

分别采集正常组、高脂组、2.5 g/kg虎杖提取物处理组以及5 g/kg虎杖物处理组的肝组织，检测IL-1β和PPAR-α基因相对表达量。使用RNAiso Plus试剂(TaKaRa，大连)提取肝组织中总RNA，通过分光光度计检测其含量和纯度(A260/A280:1.8～2.1)，然后取适量的RNA(1 μg)，使用PrimeScriptTMRT试剂进行反转录，合成cDNA，操作方法根据试剂盒说明。

根据TB GreenTMPremix Ex TaqTMII kit说明检测IL-1β和PPARα基因相对表达量：PCR反应条件：95 ℃、30 s预变性，然后 95 ℃、5 s变性，60 ℃、1 min退火延伸，40个循环。以β-actin为内参，使用2-△△Cq计算目标基因的相对表达量。特异性引物见表1。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 The primer sequences of qRT-PCR

1.6 计算公式

特定生长率(SGR，%/d)=100%×(lnWt-lnW0)/t

饵料系数(FCR)=FI/(Wt-W0)

式中，W0为鱼初体均重(g)；Wt为鱼末体均重(g)；t为饲喂天数(d)；FI为每尾鱼平均摄食饲料总量(风干样重)(g)。

1.7 数据统计分析

所有实验数据使用SPSS 20.0软件包进行数据分析，其值以均值±标准误表示。各组间数据差异通过单因素方差进行(ANOVA)统计学分析，并对不同组间数据进行Tukey多重比较，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 虎杖提取物对尼罗罗非鱼生长的影响

表2数据显示，投喂60 d后，高脂组特定生长率(SGR)略低于正常组，而饵料系数略高于正常组，但均无显著性差异，表明高脂饲料投喂60 d后对尼罗罗非鱼生长无明显影响。正常组、高脂组以及两个虎杖提取物处理组的SGR和饵料系数均无显著差异，表明不同剂量的虎杖提取物添加对尼罗罗非鱼生长并无显著影响。

表2 虎杖提取物对尼罗罗非鱼生长的影响Tab.2 Effects of PCE on the growth of O.niloticus

2.2 虎杖提取物对尼罗罗非鱼血脂水平的影响

高脂饲料投喂后，尼罗罗非鱼TG、TC、LDL-c、HDL-c含量显著升高。与高脂组相比，5 g/kg虎杖提取物组TG、TC、LDL-c、HDL-c含量均显著降低；2.5 g/kg虎杖提取物组仅TG含量显著降低。而两个虎杖提取物处理组间无显著差异。同时，虎杖提取物对尼罗罗非鱼血脂水平的影响呈剂量依赖性，即5g/kg虎杖提取物组效果较好(图1)。

图1 虎杖提取物对尼罗罗非鱼血脂水平的影响Fig.1 The effects of PCE on the blood lipid level in O.niloticus不同字母表示组间具有差异显著P<0.05，下同

2.3 虎杖提取物对尼罗罗非鱼血清GPT和GOT活力的影响

与正常组相比，高脂饲料投喂60 d后，尼罗罗非鱼血清中GPT和GOT活性均显著提高，表明尼罗罗非鱼肝组织受损。 而经2.5 g/kg、5 g/kg虎杖提取物处理后， GPT活性均显著下降；GOT活性也呈下降趋势，但差异不显著(图2)。结果表明虎杖提取物可部分改善尼罗罗非鱼肝损伤。

图2 虎杖提取物对尼罗罗非鱼GPT和GOT活性的影响Fig.2 The effects of PCE on GPT and GOT activities in O.niloticus

2.4 虎杖提取物对尼罗罗非鱼肝脏中TG和TC含量的影响

由图 3 可知，与正常组相比，高脂组中肝脏TG和TC含量均显著升高。2种剂量虎杖提取物组中肝脏TG和TC含量均呈下降趋势，但5 g/kg虎杖提取物组TG和TC含量显著降低，表明高剂量虎杖提取物处理可有效改善尼罗罗非鱼肝脂肪的沉积。

图3 虎杖提取物对尼罗罗非鱼肝TG和TC含量的影响Fig.3 The effects of PCE on hepatic TG and TC levels in O.niloticus

2.5 虎杖提取物对尼罗罗非鱼肝组织抗氧化能力的影响

由图4所示，高脂组SOD、T-AOC和GSH水平明显低于正常组，而MDA含量明显高于正常组，表明高脂饲料投喂引起氧化损伤和脂质过氧化。与高脂组相比，虎杖提取物组SOD活性显著提高、T-AOC和GSH含量显著增加， MDA含量显著降低； 2.5 g/kg虎杖提取物组SOD活性显著提高和GSH含量显著增加， MDA含量显著降低。表明虎杖提取物可有效阻止高脂饲料诱导的氧化损伤和脂质过氧化。

图4 虎杖提取物对尼罗罗非鱼肝组织抗氧化能力的影响Fig.4 The effects of PCE on anti-oxidative capacity in liver of O.niloticus

2.6 虎杖提取物对尼罗罗非鱼IL-1β和PPAR-α基因表达的影响

由图5可知，与正常组相比，高脂饲料投喂显著上调了促炎性因子白细胞介素1β (IL-1β)基因表达，而显著下调了过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPAR-α)基因表达。与高脂组相比，2.5和5 g/kg虎杖提取物组显著抑制了IL-1β基因表达；而5 g/kg虎杖提取物组PPAR-α基因表达显著提高，表明虎杖提取物具有缓解炎症反应和促进肝脂肪代谢的作用。

图5 虎杖提取物对尼罗罗非鱼IL-1β和PPAR-α基因表达的影响Fig.5 The effects of PCE on IL-1β and PPAR-α gene expression in liver of O.niloticus

3 讨论

鱼类脂肪肝经常伴随着血脂水平的升高，如TG、TC、LDL-c和HDL-c。因此血脂水平常被用于脂肪肝评估。本研究结果显示，高脂饲料投喂60 d后，尼罗罗非鱼血脂水平显著升高，表明尼罗罗非鱼出现明显的脂肪肝。而虎杖提取物处理后血脂水平明显降低，表明虎杖提取物可调节脂肪代谢、降低血脂水平、缓解脂肪肝的发生。类似的结果在哺乳动物中也发现[13,14]。肝组织中过多的脂质沉积通常引起肝损伤，导致肝细胞膜通透性增强，细胞内可溶性酶，如GPT和GOT大量释放进入血液。因此GPT和GOT是判断肝损伤重要标志。本研究中，高脂饲料投喂60 d后，血清中GPT和GOT的活性显著增加，表明高脂饲料投喂引起严重的肝损伤。而虎杖提取物明显缓解了GPT活性上升，而对GOT活性无明显影响。表明虎杖提取物可部分地缓解高脂饲料诱导的肝损伤。同样，在鲤的研究中也显示虎杖提取物可降低血清中GPT和GOT活性，抑制急性肝损伤[12,15]。

大量的研究发现，在脂肪肝发生和发展中，氧化应激发挥重要的作用。SOD、GSH和T-AOC是评价机体氧化应激状态的重要指标[16-18]。而MDA 是氧化应激和脂质过氧化物的代谢产物，其含量变化反映了脂质过氧化程度。杜金梁等[15]研究发现，虎杖提取物能显著提高T-AOC、SOD、GSH含量，降低MDA含量，防治鲤肝损伤。本研究数据显示，高脂饲料引起肝组织抗氧化指标SOD、GSH和T-AOC水平降低，而5 g/kg虎杖提取物处理组中SOD、GSH和T-AOC水平显著升高，表明高剂量虎杖提取物能促进尼罗罗非鱼肝组织中抗氧化酶活力和抗氧化物质的形成，进而清除多余的自由基，抑制高脂饲料引起的氧化应激，阻碍进一步的肝损伤发生。同时，虎杖提取物显著降低MDA含量，表明虎杖提取物能够抑制肝组织中脂质过氧化的产生，阻止肝细胞细胞膜的结构与功能受损。这与在小鼠中的研究结果一致[14]。

研究表明长期的高脂饲料投喂可促使肝脏分泌炎症因子，其中IL-1β为主要的促炎症因子，在肝损伤发展过程中发挥重要的作用[19]。IL-1β可诱导其他炎症因子、趋化因子和黏附分子分泌，参与炎症反应、脂质代谢和免疫调节[20]。本研究结果发现，长期的高脂饲料投喂导致尼罗罗非鱼肝脏炎症基因IL-1β表达明显上调，而IL-1β基因表达的上调在两种剂量虎杖提取物处理组中均受到明显抑制，表明虎杖提取物可抑制肝脏炎症反应，阻碍肝组织进一步损伤。

肝细胞中，脂肪沉积主要与脂肪酸合成和β-氧化相关。PPAR-α为脂肪酸β-氧化的关键调控因子[21]。PPAR-α的上调可促进脂肪酸分解，降低脂质沉积。很多研究显示，高脂饲料诱导的脂肪肝中，PPAR-α基因或蛋白表达被抑制[22,23]。本研究结果也显示，高脂饲料投喂60 d后，尼罗罗非鱼PPAR-α基因表达明显下调，表明尼罗罗非鱼脂肪肝发生与脂肪酸β-氧化抑制有关。而虎杖提取物处理后，PPAR-α基因表达明显上调，表明虎杖提取物可促进肝细胞脂肪酸β-氧化，抑制脂肪过度的沉积，缓解脂肪肝发生。

综上所述，虎杖提取物可干预高脂饲料引起的尼罗罗非鱼肝脂肪代谢紊乱；同时可提高抗氧化状态、抑制脂质过氧化和炎症反应，缓解高脂饲料诱导的脂肪性肝损伤。