细菌分离鉴定及药敏试验

通过病样采集、细菌分离鉴定及药敏试验，科学指导了养殖生产过程中的细菌病防治。

1.主要症状 鳃部充血、鳍条出血、皮肤溃疡、鳞片脱落、黏液增多，解剖可见腹水、内脏出血、水肿等症状，初步诊断为细菌性感染。

2.样品处理 将病鱼在无菌环境下剖解，取内脏置于无菌平皿中，用灭菌剪刀剪取其横断面，制备菌液。

3.药敏试验 将菌液取100微升涂板，贴药敏纸片，18℃下培养20 小时，测定抑菌圈直径，参照NCCLS 的判断标准进行结果判定，显示头孢他啶、头孢噻肟、头孢哌酮、阿米卡星和左氟沙星抑菌效果最佳。

4.细菌分离纯化 在普通营养琼脂平板划线接种，18℃培养24 小时，观察平板细菌生长情况，根据菌落的形态特点，挑取多个典型单菌落，涂片，镜检。如此反复，直到纯化为单一菌落。

5.16S rRNA 序列分析 根据TIANamp Bacteria DNA Kit 试剂盒说明书提取分离菌株的基因组DNA。

根据平板上菌落的颜色、形态、大小等特征挑取不同菌落于含LB 液体培养基的试管中(共12 管)，18℃过夜培养，第2 天依据细菌DNA 提取试剂盒的操作流程分别提取12株细菌的DNA，并进行PCR 扩增。反应体系：Premix Taq™(Ex Taq™Version 2.0 plus dye)12.5 微升，DNA 模板1 微升，上、下游引物各1 微升，dd 水补足至25 微升。反应条件：95℃预变性3 分钟，95℃变性30 秒，退火55～65℃，延伸90 秒，Cycle 39×，再延伸5 分钟，4℃下保存。用1.5%琼脂糖凝胶电泳并查看结果。

将PCR 产物条带切割，放入1.5 毫升离心管中，根据胶回收试剂盒的操作流程分别对12 株菌落进行胶回收。最终将PCR胶回收产物再次用琼脂糖凝胶验证后送金唯智公司进行16S rRNA测序。

图1 纯化后的PCR扩增产物

金唯智公司测序返回的12 株细菌序列分别进行拼接并在NCBI中比对，结果见表1。

表1 菌株16S rRNA 序列分析

通过对病鱼主要组织和内脏器官进行初步诊断及病原菌分离、16S rRNA 扩增和测序，检测到假单胞菌、腐败希瓦氏菌、温和气单胞菌、紫色杆菌等多种病原菌，并通过药敏试验，筛选出氯霉素、复方新诺明等敏感药物，为科学指导养殖生产过程中的细菌病防治提供了一定依据。