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细菌分离鉴定及药敏试验
通过病样采集、细菌分离鉴定及药敏试验,科学指导了养殖生产过程中的细菌病防治。
1.主要症状 鳃部充血、鳍条出血、皮肤溃疡、鳞片脱落、黏液增多,解剖可见腹水、内脏出血、水肿等症状,初步诊断为细菌性感染。
2.样品处理 将病鱼在无菌环境下剖解,取内脏置于无菌平皿中,用灭菌剪刀剪取其横断面,制备菌液。
3.药敏试验 将菌液取100微升涂板,贴药敏纸片,18℃下培养20 小时,测定抑菌圈直径,参照NCCLS 的判断标准进行结果判定,显示头孢他啶、头孢噻肟、头孢哌酮、阿米卡星和左氟沙星抑菌效果最佳。
4.细菌分离纯化 在普通营养琼脂平板划线接种,18℃培养24 小时,观察平板细菌生长情况,根据菌落的形态特点,挑取多个典型单菌落,涂片,镜检。如此反复,直到纯化为单一菌落。
5.16S rRNA 序列分析 根据TIANamp Bacteria DNA Kit 试剂盒说明书提取分离菌株的基因组DNA。
根据平板上菌落的颜色、形态、大小等特征挑取不同菌落于含LB 液体培养基的试管中(共12 管),18℃过夜培养,第2 天依据细菌DNA 提取试剂盒的操作流程分别提取12株细菌的DNA,并进行PCR 扩增。反应体系:Premix Taq™(Ex Taq™Version 2.0 plus dye)12.5 微升,DNA 模板1 微升,上、下游引物各1 微升,dd 水补足至25 微升。反应条件:95℃预变性3 分钟,95℃变性30 秒,退火55~65℃,延伸90 秒,Cycle 39×,再延伸5 分钟,4℃下保存。用1.5%琼脂糖凝胶电泳并查看结果。
将PCR 产物条带切割,放入1.5 毫升离心管中,根据胶回收试剂盒的操作流程分别对12 株菌落进行胶回收。最终将PCR胶回收产物再次用琼脂糖凝胶验证后送金唯智公司进行16S rRNA测序。
图1 纯化后的PCR扩增产物
金唯智公司测序返回的12 株细菌序列分别进行拼接并在NCBI中比对,结果见表1。
表1 菌株16S rRNA 序列分析
通过对病鱼主要组织和内脏器官进行初步诊断及病原菌分离、16S rRNA 扩增和测序,检测到假单胞菌、腐败希瓦氏菌、温和气单胞菌、紫色杆菌等多种病原菌,并通过药敏试验,筛选出氯霉素、复方新诺明等敏感药物,为科学指导养殖生产过程中的细菌病防治提供了一定依据。
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