罗非鱼加工副产物不同部位硫酸软骨素的制备、理化性质及结构表征

硫酸软骨素（CS）是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，由交替的D-葡萄糖醛酸（GlcA）和N-乙酰氨基半乳糖（GalNAc）连接的二糖单位组成。相比之下，由于陆地动物存在疯牛病，猪霍乱和口蹄疫等疾病，海洋来源的CS安全性更高。然而，商品化CS主要是鲨鱼来源，其资源珍稀且价格昂贵，因此寻找经济且安全性高的CS新来源受到学者们的广泛关注。

广东海洋大学食品科技学院，广东省水产品加工与安全重点实验室，广东省海洋生物制品工程实验室，广东省海洋食品工程技术研究中心的左格格、钟赛意*等以罗非鱼副产物不同部位为原料制备CS，并对其理化性质和精细结构进行分析，评估罗非鱼下脚料是否可以作为商品化CS的一个潜在来源，旨在为罗非鱼副产物的高值化开发利用提供参考。

1、理化性质分析

如表1所示，罗非鱼副产物不同部位CS的理化性质具有差异性。4 个部位CS的总糖含量和糖醛酸含量没有显著差异。鱼头和鱼尾的CS含量、GlcN含量、硫酸基含量没有显著差异。其中鱼头部位的CS质量分数和提取率最高，分别达到（90.37±1.77）%和1.02%，可能是CS主要存在于软骨中；鱼尾、鱼鳍和鱼脊骨CS质量分数分别为（83.33±17.88）%、（59.76±1.22）%和（52.01±3.15）%。GlcN质量分数依次为鱼尾、鱼头、鱼鳍、鱼脊骨，最高达（19.28±1.62）%，最低为（2.49±0.62）%。4 个部位CS的硫酸基质量分数依次为鱼头（22.89±0.11）%、鱼尾（22.72±2.92）%、鱼鳍（18.34±0.42）%、鱼脊骨（12.56±0.28）%，差异明显。4 个部位CS的蛋白质含量较低，说明三氯乙酸除蛋白效果较好。

2、结构表征

紫外波长扫描光谱

如图1所示，罗非鱼副产物不同部位CS和CS标准品都在190～200 nm之间具有糖类特征吸收峰，且峰形均较窄、尖锐、无其他杂峰。其中鱼头和鱼脊骨CS在260 nm波长处有微弱的吸收峰，说明含有少量的核酸。4 个部位CS在280 nm波长处都没有蛋白质的吸收峰，表明纯度较好。

醋酸纤维膜电泳

如图2所示，CS-C和CS-A的结构相似，但CS-C的硫酸化程度和电荷密度较高，因此迁移率表现比CS-A快。罗非鱼副产物不同部位CS的电泳条带单一、较窄，说明不含其他糖胺聚糖且电荷均一。4 个样品的迁移率与CS标准品接近，均含有不同比例的CS-A和CS-C。

傅里叶变化红外光谱分析

如图3所示，4 个部位CS在4 000～1 300 cm-1范围内无明显区别，而在1 300～400 cm-1指纹区域内有细微差别。鱼头和鱼尾CS红外图谱在指纹区与CS-C标准品相近，而鱼脊骨和鱼鳍CS与CS-A标准品相似。如表2所示，4 个样品CS相同之处在于：在3 400 cm-1附近处由O—H伸缩振动引起，说明存在氢键，且峰形均较宽；2 900 cm-1附近有糖类物质的特征吸收峰；1 640 cm-1和1 550 cm-1附近有—NHCOCH3—的C＝O伸缩振动和N—H变角振动，属于酰胺I吸收带；1 420 cm-1附近存在羧基的C＝O伸缩振动；1 370 cm-1附近有以GlcA形式存在的O—H变角振动；1 240 cm-1附近存在硫酸基；1 040 cm-1和920 cm-1附近存在吡喃糖伸缩振动，说明4 个部位CS都存在糖环、乙酰氨基、硫酸基、羟基和羧基等官能团，具有CS的基本结构。

分子质量分析

如图4所示，罗非鱼下脚料不同部位CS的出峰时间和CS标准品一致，其中倒峰是溶剂NaNO3的峰，相比较而言样品CS的峰形对称性较差且有杂峰，表明样品中含有小分子杂质。将保留时间代入不同分子质量葡聚糖所得的线性回归方程，结果如表3所示。

CS的相对分子质量一般在5 000～50 000范围内，罗非鱼副产物不同部位CS的分子质量属于CS类。比较发现，鲨鱼来源CS-C标准品的mn、mw和mz均显著高于牛软骨来源的CS-A标准品。鱼脊骨和鱼鳍CS的mn较接近，分别为18 402和19 481，接近但均低于CS-A。而鱼头和鱼尾CS的mn介于CS-A和CS-C之间，分别为51 422和76 371。鱼头CS的mw和mz都高于其他3 个部位CS，显著低于CS-C标准品。

单糖组成分析

采用PMP衍生法，以CS-A和CS-C为参照，对罗非鱼副产物不同部位CS进行单糖组成测定，色谱图如图5所示，分析结果如表4所示。

4 个部位CS和标准品的单糖种类相似，主要含有GlcA、Glc、GalN，以及少量的GlcN、GalA、GlcNA、Gal、Xyl、Ara。鱼头CS不含有GalA，鱼尾CS含有少量的Man。不同部位CS在13 min都在出现了与标准品出峰时间不匹配的未知峰，可能是未降解的寡糖片段，这与分子质量分析结果一致。

二糖组成分析

将罗非鱼副产物不同部位CS用硫酸软骨素酶降解，利用强阴离子交换-HPLC对酶解产物进行分析，色谱图如图6所示。CS-A和CS-C的硫酸基团位置和数量不同，CS-A中Δdi4S比Δdi6S多，而CSC相反。如表5所示，4 个部位CS均不含三硫酸化二糖。其中鱼头CS不含有二硫化二糖，Δdi6S（46.10%）比Δdi4S（41.01%）含量高，属于CS-C。鱼尾也是CS-C，与鱼头不同的是还含有0.68%二硫酸二糖（Δdi2,6S）。鲨鱼CS主要由单硫酸二糖Δdi6S（40.8%）和Δdi4S（34.9%）组成，从罗非鱼头和鱼尾提取的CS与鲨鱼CS的二糖组成相似。Δdi4,6S（1.21%）只在鱼脊骨CS中存在，除此之外还包含Δdi2,4S（0.46%），但Δdi4S（71.86%）含量最高，主要为CS-A。鱼鳍CS与鱼脊骨CS二糖组成相似，但不含有Δdi4,6S而是含有0.41%的Δdi2,6S二硫化二糖，主要为CS-A。根据Δdi4S和Δdi6S物质的量比（4S/6S）可得出相同结论，与红外光谱扫描的结果一致。硫酸化程度和电荷密度呈正比，4 个部位CS的电荷密度0.96～0.81不等，其中鱼鳍CS电荷密度最高，硫酸根含量最高；其次是鱼脊骨CS，最低的是鱼尾CS，这与醋酸纤维膜电泳结果相同。

一

结论

结果表明，鱼头、鱼尾所含硫酸软骨素主要为C型（Δdi6S），含量分别为46.10%和41.01%；鱼脊骨、鱼鳍所含硫酸软骨素主要为A型（Δdi4S），含量分别为71.86%和69.59%。纯度从高到低依次为鱼头90.37%、鱼尾83.33%、鱼脊骨59.76%、鱼鳍52.01%。鱼头、鱼脊骨、鱼鳍、鱼尾硫酸软骨素的单糖组成主要由不同比例的葡萄糖醛酸、葡萄糖和氨基半乳糖构成，mn依次为51 422、18 402、19 481、76 371。不同部位提取的硫酸软骨素的种类和组成有明显差异，其中罗非鱼头、鱼尾提取的硫酸软骨素与鲨鱼软骨来源硫酸软骨素结构相似，有望作为代替鲨鱼硫酸软骨素的潜在来源。