鱼类虹彩病毒病及其疫苗的研究进展

鱼类虹彩病毒病及其疫苗的研究进展

文/巩金鹏 潘晓艺 朱悦 沈锦玉

鱼类疾病会给水产养殖带来较大经济损失，而疫苗是预防鱼类疾病的有效措施之一。本文就近年来报道中热度逐年上升的虹彩病毒病进行简要介绍，并概述了虹彩病毒疫苗的研发进展，以期为我国鱼类虹彩病毒疫苗的研究与推广提供理论基础。

渔业不仅是国民经济的重要组成部分，而且为国家粮食安全和社会发展作出了贡献。根据2020中国渔业统计年鉴统计显示，全国水产养殖产量5079.07万吨，同比增长1.76%。2019年全国水产养殖面积7108.50千公顷，其中海水养殖面积1992.18千公顷，淡水养殖面积5116.32千公顷。然而，疾病的流行给水产养殖业带来了不少的损失。挪威学者Øystein Evensen研究估计，有10%的养殖水生动物由于传染病而损失，全球范围内每年损失超过100亿美元。《2020年我国水生动物重要疫病状况分析》显示我国近几年因病造成渔业损失已超过400亿人民币。病毒性疾病是鱼类养殖中常见的病害，自从美国学者Wolf第一次分离到鱼类病毒（传染性胰腺坏死病毒），目前已知的鱼类病毒有70几种。根据国际病毒分类学委员会（ICTV）对虹彩病毒科的记载，虹彩病毒属物种在自然宿主范围和毒力方面差异很大，蛙虹彩病毒属、细胞肿大病毒属都在内脏器官内复制，尽管发病率和死亡率因特定病毒、宿主和环境而异，但死亡率水平有时可接近100%，而感染淋巴囊肿病毒的鱼在外表面（有时是内部器官）上显示出疣状生长，但感染会自发消退，死亡率通常较低。它们可以通过注射或浸泡进行实验传播，也可以通过共同生活和喂养自然传播。

一、虹彩病毒科

国际病毒分类学委员会（ICTV）第十次病毒分类报告将虹彩病毒科分为五个属：蛙虹彩病毒属、淋巴囊肿病毒属、细胞肿大病毒属、虹彩病毒属、绿虹彩病毒属，其中蛙虹彩病毒属、淋巴囊肿病毒属、细胞肿大病毒属感染脊椎动物（如硬骨鱼、两栖动物和爬行动物），虹彩病毒属、绿虹彩病毒属感染无脊椎动物（如昆虫和甲壳动物）。此外，在该科中还有一些未被归入属的病毒，由于本文仅涉及鱼类虹彩病毒疫苗，所以围绕蛙虹彩病毒属、淋巴囊肿病毒属、细胞肿大病毒属展开综述。

虹彩病毒的病毒粒子呈二十面体对称，直径通常为120nm～200nm，但也可能高达350nm（如淋巴囊肿病毒属）。病毒基因组为线性双链的DNA，大小范围在103kbp～220kbp，具体取决于病毒种类。相对分子质量是1 3 0×1 06，G+C的含量为29%～58%。病毒DNA环状排列和末端冗余的，会使基因组的大小增加10%～30%。

虹彩病毒抵抗力强，感染培养物在23℃下可存放几个月。与其它病毒相比，反复冻融对其影响较小，使用时间间隔短时可存放于4℃或-20℃，长期保存时可存放于-80℃或液氮。此外病毒对脂溶性溶剂敏感。

（一）蛙虹彩病毒属

该种类病毒基因组呈环状排列，约30%的末端冗余，大小范围是104kbp～140kbp，G+C含量为49%～55%。蛙虹彩病毒属是虹彩病毒科中成员最多的属，其大部分病毒会引起水生动物疾病，包括流行性造血器官坏死病毒（EHNV）、欧鲇病毒（ESV）、欧洲鲶鱼病毒（ECV）、大口黑鲈虹彩病毒（LMBV）、新加坡石斑鱼虹彩病毒（SGIV）等数十种病毒。蛙虹彩病毒属病毒感染宿主范围广泛，涉及鱼类、两栖类、爬行类近百种水生动物，而且发病率和死亡率都很高。EHNV限于澳大利亚；ESV、ECV限于欧洲大陆；LMBV主要感染大口黑鲈，在北美和亚洲的几种淡水鱼也有报道；SGIV会导致亚洲多种海水鱼类患病。其中，国内外大口黑鲈虹彩病毒研究报道最多。

大口黑鲈虹彩病被发现于1996年，美国桑蒂-库珀水库大口黑鲈大规模死亡，经过检测鉴定，初步归纳为虹彩病毒科，命名为LMBV。在国内，2008年广东省顺德大口黑鲈暴发疾病，患病鱼会表现体表溃烂，部分鱼会失去平衡，肝脾肾肿大并伴有出血，对濒死鱼剖检，鱼鳔、肾脏研磨除菌后，接种鲤鱼上皮瘤细胞分离到致病性大口黑鲈虹彩病毒，命名为LMBV-C株。LMBV在夏季发病，尤其是在水温28℃左右发病。通过腹腔注射进行人工感染，大口黑鲈会出现肝脏苍白、皮肤充血、注射部位炎症、腹膜炎和胃肠道粘膜上皮细胞局灶性坏死等症状。LMBV可以使用常用的细胞系进行分离，包括BF-2、FHM、CO和EPC细胞。常规聚合酶链反应和实时荧光定量聚合酶链反应被认为是LMBV的特异性检测方法，它们主要的靶标基因是病毒主要衣壳蛋白基因和聚合酶基因。

（二）细胞肿大病毒属

该种类病毒基因组DNA甲基化，大小范围在105kbp～118kbp，G+C含量为53%～55%，病毒粒子二十面体对称，直径140nm～200nm，大约有120个开放阅读框，约70%是该属所特有的。通过56℃，30min的加热、紫外照射、乙醚以及暴露于pH3以下、pH11以上环境可灭活，包括传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）、真鲷虹彩病毒（RSIV）等病毒。细胞肿大病毒1990年首次发现于患病真鲷，经检测属于虹彩病毒。2005年根据患病鱼组织学检查中观察到的肥大细胞外观，对病毒进行分类，将其确认为虹彩病毒科第五属。细胞肿大病毒在热带和温带地区都有发现，在东南亚和东亚最常见，该属的病毒有一个广泛的宿主范围，包括50种鱼类。在国内，1994年鳜鱼被确认为由ISKNV引起疾病，患病鱼表现出活动减少和进食减少、体色苍白和鳃苍白等临床症状。由肿大细胞病毒引起的疾病综合征，在死亡之前都表现出全身性疾病的非特异性体征，死亡率通常在20%～60%之间，在集约化水产养殖中，鱼类的死亡率有时甚至达到100%。

（三）淋巴囊肿病毒属

该种类病毒高度甲基化，大小范围在103kbp～186kbp，G+C含量为27%～29%，病毒粒子直径198nm～300nm，衣壳纤维将它与其它两种虹彩病毒区别开来。病毒不耐热，对乙醚和甘油较敏感，对干燥和冷冻很稳定。其传染性在18℃～20℃的水中能保持5d以上，在温度-20℃下2年仍具有感染力，包括淋巴囊肿病毒（LCDV）等病毒。1874年，淋巴囊肿病在欧洲河鲽上被首次发现，之后在许多淡水海水鱼类都有所发现，是被发现最早的鱼类病毒病。1965年采用细胞培养和电镜技术后，被确认为属于虹彩病毒。已有报道显示，该病感染的鱼类有100多种，流行范围广，以海水鱼类为主。我国养殖的牙鲆易发生此病，患病鱼病变处表现为花椰菜样，鳍上病变典型，且容易再次感染。有研究表明牙鲆感染淋巴囊肿病毒在适应温度下会自愈，水温在18℃时发病严重，肿瘤生长较快；14℃或低于14℃，肿瘤生长缓慢；24℃以上，出现自愈现象，但是其外观难看，患病鱼无法再销售。LCDV对成纤维细胞有趋向性，局限于真皮，而不会引起全身感染。该病毒不易培养，虽然具有高度传染性，但通常被认为是一种致死率较低的感染，会影响淡水和海洋环境中野生捕获的鱼类。

二、虹彩病毒疫苗

自从1976年在美国获批第一个商业化水产疫苗“鲑鱼红嘴病疫苗”以来，水产疫苗获得快速发展。全球目前有24种已获商业许可的鱼类疫苗，可用于多种鱼类，这些疫苗包括灭活疫苗、活疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、活载体疫苗和合成肽疫苗等。大多数鱼类疫苗主要是灭活疫苗，它们是由佐剂配制，并通过浸泡或注射途径免疫。活疫苗更有效，因为它们模拟自然病原体感染并产生强烈的抗体反应，因此主要通过口服或浸泡途径给予。虹彩病毒疫苗目前在国内获得新兽药证书的有鳜传染性脾肾坏死病灭活疫苗和进口注册的鱼虹彩病毒灭活疫苗。下面将根据疫苗不同种类介绍鱼类虹彩病毒疫苗研究应用进展。

（一）灭活疫苗

灭活疫苗是通过将培养的细菌或病毒灭活，使其失去复制和感染力，但不破坏其抗原性的疫苗。针对鱼类虹彩病毒灭活疫苗，早在1999年Kazuhiro Nakajima等通过福尔马林灭活培养真鲷虹彩病毒，通过腹腔注射免疫，观察12周，再用真鲷虹彩病毒进行感染，免疫组的死亡率（19.2%）显著低于未免疫组（68.5%），免疫组体重明显大于对照组。董传甫等通过用福尔马林灭活细胞培养（FKC）疫苗，免疫保护实验表明，免疫FKC疫苗的鱼90%以上能抵抗ISKNV，免疫鱼的血清在体外和体内都显著抑制病毒感染，从免疫鱼血清中纯化的IgM在体内也显示出有效的中和作用。并且研制基于MFF-1细胞培养系统的佐剂型ISKNV细胞灭活疫苗，实验室内对鳜鱼的免疫保护率达100%，田间试验免疫保护率在95%以上。樊廷俊等将大菱鲆病毒性红体综合征虹彩病毒用0.1%福尔马林灭活，用0.5%氢氧化铝配制灭活疫苗，通过肌肉注射接种疫苗两次后，大菱鲆以剂量依赖的方式产生了高滴度的TRBIV中和抗体。在实验室通过皮下接种确定的免疫保护率为83.3%，在大菱鲆养殖场通过浸泡接种确定的免疫保护率为90.5%。刘文枝等用β-丙内酯灭活大鲵虹彩病毒并免疫，评估红细胞和白细胞计数和分类、吞噬活性、中和抗体滴定、免疫相关基因表达和相对存活率的测定。免疫后第4d和第7d，中国大鲵外周血红细胞和白细胞数量显著增加（P＜0.01），单核细胞和中性粒细胞的白细胞计数与对照组相比有显著差异（P＜0.01）；免疫相关基因TLR-9和MyD88的表达显著上调，免疫组的相对存活率为72%。Zhengliang Ou-yang等研究了两种疫苗对石斑鱼的免疫原性和病毒感染的保护作用。分别用β-丙内酯和福尔马林灭活新加坡石斑鱼虹彩病毒，免疫后30d，存活率分别为91.7%和100%。并且诱导了早期的非特异性抗病毒免疫，以及随后的特异性免疫反应，包括体液免疫和细胞免疫。Jiacheng Zhang等制备灭活ISKNV疫苗，以聚异戊二烯、壳聚糖和山莨菪碱不同的佐剂评价免疫应答的影响，壳聚糖能增强对肝脾组织的保护作用，聚异戊二烯和壳聚糖对过氧化氢酶、酸性磷酸酶、血尿素氮有保护作用，聚异戊二烯、壳聚糖和山莨菪碱显著提高了抗病毒功能，抑制了病毒复制，壳聚糖和山莨菪碱在免疫保护率试验中具有显著的保护作用，这些佐剂还可以诱导脾和中肾细胞早期免疫应答的细胞因子。

（二）活疫苗

活疫苗是由一种或多种病毒或细菌制备的，这些病毒或细菌对目标鱼种表现出弱毒力或天然低毒力。虹彩病毒疫苗在这方面研究较少，So-Young Oh等在低温下（＜18℃）对条石鲷进行低拷贝的真鲷虹彩病毒（RSIV）的感染，表明在低温下存活的RSIV鱼受到了强烈的保护，不受同源RSIV的再攻毒；RSIV对条石鲷产生保护性免疫反应的阈值水平≤105.4 genomes /mg，当条石鲷在18℃饲养并接种RSIV时，存活的鱼可以对RSIV产生保护性免疫应答，这表明该RSIV活疫苗对条石鲷具有积极的保护作用。Yi-Fan Lin等利用同源重组技术构建ΔORF069L重组病毒株。与自然感染ISKNV的鱼相比，感染ΔORF069L的鱼免疫相关基因（Mx1、IL-1β、IL-8、TNF-a和IgM）的表达水平增加，此外，由ΔORF069L引起的致死率比自然感染ISKNV的鱼下降了40%，最重要的是，用ΔORF069L株免疫的鱼保护率接近100%，这些研究将有利于促进ISKNV疾病基因缺失减毒疫苗的发展。

（三）亚单位疫苗

亚单位疫苗利用抗原成分进行疫苗接种，由于亚单位疫苗不能在宿主中复制，因此对宿主或非目标菌种没有致病性风险。Hong-Jen Liang等通过将佐剂NE与GIV重组主要衣壳蛋白（MCP）结合制备浸泡亚单位疫苗，浸泡20min以后会检测到绿色荧光蛋白，浸泡2周后可检测到MCP特异性抗体，最初接种疫苗10周内，所有鱼对GIV都有抗性。与单一疫苗组相比，该疫苗的抗体水平和对鱼体保护效应都有所加强，病毒载量相对较低。付小哲等通过将编码虹彩病毒的主要衣壳蛋白（MCP）的基因克隆到温度诱导原核表达载体pBV220中，并检测到分子量为50kDa重组蛋白，重组蛋白通过透析复性，分别以每条鱼20μg、50μg、100μg的剂量通过腹腔内注射用ISA 763佐剂乳化的重组MCP接种于鳜鱼幼鱼，三组（按照接种剂量称为MCP20、MCP50、MCP100）均检测到特异性抗体和淋巴细胞增殖，MCP50组高于其他两组，用ISKNV攻毒感染后，MCP50组鱼的存活率明显高于其他组，RPS为64.3%。Zhao Zhao等研究发现以单壁碳纳米管为辅配合ISKNV亚单位疫苗与单独接种ISKNV亚单位疫苗的鱼相比，前者具有免疫反应更强，时间更长的优势，相对存活率是28.1%。单壁碳纳米管可以增强裸亚单位疫苗的保护作用，可大规模接种鳜鱼幼鱼。Yong Zhou等人成功地在酵母中连接了虹彩病毒的MCP，发现它在纯化后能组装成VLP，并且还可以给大鲵中提供保护性免疫，使其红细胞和白细胞数量增加，免疫后第21d，血清中和抗体的效价达到321，对照组仍保持在50以下。此外，攻毒后14d，VLP免疫组的累积死亡率为20%，对照组为93%。

（四）DNA疫苗

DNA疫苗是一种带有特异性抗原编码的表达质粒，它在宿主体内表达时会引起强烈的免疫反应。曾宪辉等利用虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP基因制备重组质粒pc-DNA-MCP，接种免疫大鲵后其红细胞、单核细胞等数量增加明显，在大鲵体内检测到抗MCP的抗体，免疫28d后抗体效价达到峰值。攻毒结果与对照组相比，相对免疫保护率为73.3%。付小哲等利用病毒编码的主要衣壳蛋白MCP基因构建重组质粒pcMCP，pcMCP添加QCDC佐剂免疫，IRF-7、IRAK1等免疫基因的表达水平上升，免疫后攻毒，相对存活率为80%。Christopher Marlowe Arandela Caipang等选择编码衣壳蛋白（pCMV-MCP）的ORF和含有跨膜结构域的（pCMV-569）两种DNA疫苗进行研究，pCMV-MCP组、pCMV-569组、同时接种两种DNA疫苗组、福尔马林组与PBS组对比，DNA疫苗组MHC I类表达水平接种15d以后显著增加，在疫苗效力实验中，DNA疫苗组鱼的相对存活率为42.8%～71.4%，明显高于对照组。Yi-Jun Jia等利用单壁碳纳米管（SWCNT）作为疫苗载体进行免疫，SWCNT-pcDNAMCP组与PBS组、pcDNA-MCP组、纯SWCNT组相比，血清抗体水平最高，在免疫21d达到峰值，酶活性显著提高，免疫相关基因水平均升高。SWCNTs-pcDNA-MCP组对大口黑鲈免于LBUSV的保护作用最强，RPS值为61.11%。

三、讨论与展望

虹彩病毒从变温脊椎动物和无脊椎动物中分离出来，在淡水和海水中均有发现报道。在近二十年来，从起初的零星发病到淡水和海水鱼普遍都有感染，给水产养殖业造成了较大的经济损失。关于虹彩病毒相关的亚单位疫苗和DNA疫苗一般选择病毒的主要衣壳蛋白开展研究，关于病毒模式和相应属的结构是已知的，但是对于虹彩病毒病理生物学和低等脊椎动物免疫系统功能还需进一步研究。我们下一步应着力研究宿主免疫系统在对抗虹彩病毒感染中的作用，探求病毒未知免疫蛋白和抗病毒免疫关键。

目前治疗虹彩病毒的特效药物少有相关报道，但近几年蛙虹彩病毒和细胞肿大病毒逐渐受人们的关注，疫苗已成为预防虹彩病毒的关键手段，虹彩病毒由于其复杂性，在养殖过程中很难从临床病症识别，剖检镜检可以较为方便判断，但正确率不是很高，最受欢迎的仍旧是运用免疫学相关技术（酶联免疫检测、荧光抗体技术等）和聚合酶链反应技术检测病毒。

随着国家对环境加强监管，选择安全、环保、价廉的药物将是大势所趋，疫苗是目前很好的选择之一。新的鱼用疫苗应该是对动物和环境安全、经济、易于使用、能够在易感时期诱导强免疫并且有最小副作用的疫苗。当前随着全国水产养殖规模的增长，未来将需要利用水产动物免疫防御系统机能开发出高效、实用及多样化的水产疫苗。水产科技工作者要继续努力寻找具有长期保护效应的多联疫苗，并推动研发工作紧跟国际前沿，结合现阶段基础，面向水产养殖生产实际，从多方面开展相关技术研究，从而促进我国水产养殖业健康和可持续发展。