锦鲤昏睡病(KSD)的实验室诊断分析

刘 群，王 菁，刘桐山，王 钢，韩进刚，冯守明

(1.天津市动物疫病预防控制中心，天津 300402；2.天津市水产研究所，天津 300221)

锦鲤昏睡病(KSD)具有发病率高、死亡率高的特点，且呈现逐年上升态势。本研究应用流行病学调查、病理学观察、分子生物学检测等多种方法对天津地区一养殖场不明原因锦鲤死亡病例进行诊断及分析，确诊为由鲤浮肿病毒(Car p edema vir us，CEV)感染引起的锦鲤昏睡病(KSD)。现将其实验室诊断与分析结果报道如下。

一、材料与方法

1.样品取样

疾病暴发时，深入现场调查养殖水温、养殖密度、鱼龄、发病率、死亡率等情况，观察病鱼活动状态。取症状典型的发病鱼活体置于解剖盘中，检查其体表症状，解剖并剪取鳃、肝胰脏、脾、肾、脑组织，用于组织病理观察的组织块(不超过0.5厘米3)置于Davidson's AFA固定液固定；用于超微病理观察的组织块(厚度小于2毫米)置于TEM电镜固定液中固定，并做好记录。

2.寄生虫检查

观察病鱼活动情况，用显微镜检查病鱼有无寄生虫。鳃丝、体表黏液采取水浸片法，脑、肝胰脏、脾、肾组织采用压片法，血液用涂片法。制片后置于显微镜下观察发病鱼体表、鳃和其他内脏组织病变情况。

3.石蜡切片制备与观察

用于组织病理观察的组织块固定24小时后置于70%(体积分数)乙醇，浸泡36小时后即可制备病理切片。经脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、展片、烤片、脱蜡、染色、封片等步骤后，使用ZEISS光学显微镜对制备好的病理切片进行显微观察，并用Axio Cam数字摄像头结合Axio Vision图像分析软件进行拍照和测量。

4.透射电镜切片制备与观察

用于超微病理观察的组织块于4℃固定24小时后，0.1摩/升磷酸缓冲液冲洗，再经1%锇酸固定1.5小时，置于梯度乙醇脱水，经包埋剂包埋后制作超薄切片，透射电子显微镜下观察并拍照有无疑似病毒颗粒、形态特征等超微病理变化。

5.细菌分离培养

使用75%(体积分数)乙醇对病鱼体表消毒，无菌环境下采集病鱼脑、肝胰脏、脾、肾组织，于LB琼脂平板划线接种，28℃培养24小时，观察细菌生长情况。

6.分子生物学鉴定

(1)核酸提取。切取濒死病鱼鳃组织并研磨，于1.5毫升RNase-f r ee离心管中挑取少量研磨液，用全自动核酸提取纯化移液工作站(M5073，Eppendor f)提取样品核酸，并使用超微量核酸测定仪(IMPLEN，Ger man)测定其纯度及浓度。

(2)病毒PCR检测。参考鲤春病毒血症病毒(SVCV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤疱疹病毒II型(CyHV-II)、鲤浮肿病毒(CEV)相关检测方法进行相对应病毒分子生物学检测，同时以健康锦鲤基因组DNA作为阴性对照，相关检测所用引物序列及检测方法信息见表1。

表1 PCR检测所用引物序列

7.人工感染试验

取患病锦鲤鳃组织，按1∶10(质量体积比)加入无菌生理盐水，研磨匀浆并反复冻融，经差速离心收集上清液，以0.22微米滤膜过滤，采用注射终浓度2×10-2克/升组织液方式进行人工感染试验。随机取2组健康锦鲤进行腹腔注射，每组10尾；实验组与对照组分别注射0.2毫升/尾组织悬液与等剂量无菌生理盐水；(25±2)℃下水箱连续饲养31天，观察发病情况，做好记录，并及时剖检实验鱼和检测病原体。

二、结果

1.现场调查及临床症状检查

锦鲤病例样品取自于2018年7月末，养殖池塘水温为26～29℃，起初锦鲤个别死亡，但病情进展迅速。第1天仅死鱼100余尾，第2天死鱼便达500余尾，日死亡率为5%～8%。调查发现，发病锦鲤为9月龄，全长为(14±5)厘米，体质量为(48±10)克，养殖密度约400尾/米3水体。发病鱼普遍表现为横卧漂浮于养殖池浅水区水面，聚集于池角、岸边及进水口等处，体表无明显损伤；活力明显下降，初看似已死亡，一旦有声音刺激便游动，刺激结束后再次横卧，发病死亡率介于50%～80%。体表临床症状为头部上方颅骨软组织皱缩，眼球凹陷(图1)。观察病鱼体表、体内器官，其临床症状表现为鳃黏脏，黏液分泌增多，有的鳃丝不完整，肝胰脏呈现白色，大部分发病鱼脾肿大，其他组织器官无明显异常。

图1 发病锦鲤体表临床症状

2.病理切片观察结果

通过显微病理观察，患病锦鲤各组织器官出现不同程度病理变化，表现为多器官病变病理特征。其中，鳃丝末端细胞增生，呈肿大状并黏附，有融合；鳃小片上皮细胞增生且其之间隙缝被上皮细胞填满，可观察到疑似包涵体存在(图2A)。肾组织可见肾小管上皮细胞脱落水肿，部分水肿至空泡化，肾小球结构清晰可见，组织可见少量炎症细胞浸润和疑似包涵体存在(图2B)。肝细胞胞浆疏松，可见广泛水肿，部分水肿至空泡化，并可见疑似包涵体(图2C)。脾组织整体结构正常，红髓与白髓界限不清，无明显坏死，组织可见疑似包涵体、多核巨细胞和大量黑色素巨噬细胞，未见明显粒细胞浸润(图2D)。脑组织整体结构正常，细胞排列紧密整齐，分界明显，未见血管充血及炎症细胞浸润。

图2 患病锦鲤鳃、肾、肝胰脏和脾组织病理变化

3.超微病理观察结果

透射电镜观察结果显示，病鱼脾组织中可见大量晶格状排列的病毒粒子积聚(图3)，细胞结构遭破坏；此次病鱼样品观察鳃、肾、肝胰脏和脑组织中未见明显病毒粒子，故未将图片列出。

图3 发病锦鲤样品脾组织中的病毒粒子(箭头)

4.寄生虫检测和细菌分离结果

经制片和显微观察，所检锦鲤病鱼组织均未观察到寄生虫。将病鱼脑、肝胰脏、脾、肾组织病料接种于LB平板上，28℃培养24小时，未见细菌生长。

5.分子生物学检测结果

采用相关检测方法对2018年7月末采集的患病锦鲤鳃组织样品进行SVCV、KHV、CyHV-II、CEV分子生物学检测，结果显示，发病锦鲤鳃组织样品均未扩增出SVCV、KHV、CyHV-II特异性片段(未列出)；CEV TaqMan荧光定量检测方法结果如图4A，显示该样品Ct值小于35，CEV为阳性。

6.人工感染试验结果

养殖水温为(25±2)℃时，由患病锦鲤鳃组织制备组织悬液腹腔注射感染健康锦鲤，并依据《鲤浮肿病诊断规程》(SC/T 7229－2019)中的检测方法对注射组、对照组锦鲤鳃组织进行CEV TaqMan荧光定量PCR检测，结果如图4B所示。人工感染试验结果显示，注射组死亡锦鲤未呈现CEV典型症状，统计锦鲤累积死亡率，其累积死亡率为(65±7.07)%，半数致死时间(LT50)为16天；对照组累积死亡率为(15±7.07)%(图5)。CEV Taq-Man荧光定量PCR检测结果显示，注射组20尾锦鲤中有14尾为CEV阳性，其阳性检出率为70%，对照组未检出CEV。

图4 锦鲤鳃组织样品CEV TaqMan荧光定量PCR扩增曲线

图5 人工感染试验中累积死亡率与注射时间关系

三、讨论

本研究根据天津市北辰区某锦鲤养殖场患病锦鲤流行病学调查及病理学、寄生虫学、细菌学、病毒学鉴定结果，确定2018年夏季引起该养殖场锦鲤暴发性死亡的原因为锦鲤睡眠病(KSD)，其病原为鲤浮肿病毒(CEV)。

从临床症状上看，病鱼常聚集于水面或池塘边缘，或静置于池中倒向一侧，呈昏睡状态。受触动时会游动，但很快处于昏睡状态。大多表现出烂鳃、体表糜烂、出血、皮下组织水肿、眼球凹陷、食欲不振、吻端和鳍基部溃疡等临床特征(Adamek M等，2017；吕晓楠等，2018)。本研究中感染KSD锦鲤表现出与之相似的临床表观特征，不同的是笔者所解剖锦鲤未观察到体表糜烂、出血、皮下组织水肿、吻端和鳍基部溃疡病变特征。针对人工感染试验后出现的临床症状也有不同报道，Oyamatsu T等(1997b)、Miyazaki T等(2005)和刘群等(2018)通过人工感染方式回接健康鲤，导致实验鱼部分出现与自然发病鱼相似症状而死亡；Adamek M等(2016)、Matras M等(2016)和王小亮等(2017)研究发现部分实验鱼感染CEV，但未呈现典型症状和大量死亡现象。本研究人工感染试验可致70%锦鲤感染CEV，且(65±7.07)%出现死亡，但未表现出典型临床症状。由此推测，鲤感染CEV出现KSD典型临床症状和大量死亡可能由其他因素引起，仍需深入研究。

从组织病理结果上看，包括烂鳃在内的鳃丝损伤是受感染锦鲤最常见的症状。低倍镜观察到鳃组织上皮细胞过度增殖导致鳃丝肿胀；高倍镜下显示鳃细胞水肿、重度增生，鳃小片有融合及上皮细胞脱落(Lewisch E等，2015；Adamek M，2017；Ono S I，1986)。本研究显示患病锦鲤鳃组织为主要病变组织，其病理特征与Lewisch E等(2015)、Ono S I(1986)、Oyamatsu T等(1997b)的研究结果相似。此外，患KSD的锦鲤肝胰脏、肾脏和脾脏也都发生不同程度病变，出现细胞广泛水肿，可见疑似包涵体、炎症细胞浸润等较严重病理变化，而其脑组织整体结构正常，未见明显病理变化。Oyamatsu T等(1997b)认为CEV感染鲤引起的鳃损伤导致患病鱼鳃组织和内脏组织呈现病理变化。由此推测，引起KSD的致病原侵染鱼体后在最易受寄生虫或水质影响而被破坏的鳃组织内增殖，使鳃丝末端细胞增生，并随血液进入体内组织，从可能影响血液气体交换发展到体内组织发生变质性炎症，导致鱼出现缺氧、浮头、反应迟缓，致使鱼体呼吸及渗透压调节发生障碍，肝胰脏、肾、脾等重要器官正常的生理代谢功能受到损害，终至死亡。

国外现有研究表明痘病毒科种类传播主要方式是经皮肤伤口感染，并在鳃组织中观察到病毒粒子，认为鳃是CEV在鱼体内引起典型病变的主要部 位(Jung S V，2015；Rajaswaminathan T，2016；Ono S I，1986)。国内现有研究已在肾组织中观察到形态类似痘病毒颗粒(徐立蒲等，2017)，表明其可在肾组织中增殖富集。本次实验室诊断在发病鱼脾组织中观测到大量病毒样颗粒，表明除鳃、肾组织外，CEV也可在脾组织增殖，提示做病原检测等研究时，可取鳃、肾、脾组织；而电镜观测病毒方法虽直观有效，但其制备过程较复杂，周期较长，多用于科研，不适用于临床检测工作。

通常认为水温是发生CED、KSD的环境诱因。Miyazaki T等(2005)认为水温是影响CEV的重要环境因子。研究发现，较低水温(6～10℃)时，锦鲤感染CEV病程较长，死亡率较低；15～25℃时，幼鱼累积死亡率高达75%～100%；较高温度时，实验鱼最初仅昏睡，2～3天大量死亡。有调查研究发现，该病在我国河南等地有两个发病高峰时间，即5－6月和9月(吕晓楠等，2018)。这两个时间段的水温一般维持在20～27℃。本研究进行的人工感染试验可导致锦鲤累积死亡率达到(65±7.07)%，表明在(25±2)℃下CEV可致锦鲤出现大量死亡。据此推测CEV在我国传播最适水温可能是20～27℃。同时，综合现有资料，CEV可在较宽温度范围内(6～27℃)被检出，提示该病暴发可能是包括温度在内的其他因素共同作用的结果。

针对KSD防控方面，Miyazaki T等(2005)、Seno R等(2003)研究指出，将发病鱼从饲养池取出，当水温升到20～25℃时，使用6‰～7‰盐水加抗生素持续进行药浴10～14天，对防控此病有显著效果。另外，进入越冬池时，可以使用6‰～7‰盐水浴并升温，之后逐渐添加少量新水以冲淡盐水，可预防此病。但是体形较小幼鱼较难恢复，通常多在采卵时采取净化措施预防。使用此种方式能够抑制病原体黏附宿主，提高鱼体免疫力，帮助维持鱼体渗透压，有助于降低该疫病发生时鱼体死亡率，但是治愈后的鱼仍可能具有传染性，并不能从根本上杀死或消灭病毒。

本研究综合应用流行病学调查、病理学、寄生虫学、细菌学方法，并依据针对病毒P4a基因设计的荧光定量PCR检测方法将导致此次锦鲤暴发性死亡的致病原鉴定为CEV。值得注意的是，该养殖场此前未曾暴发过KSD。推测该养殖场可能存在其他途径的病原传入风险，仍有待进一步调查以证实。因此，在生产中要严格执行消毒和隔离制度，通过检测、检疫防止病原侵入，采取生物安保措施防范KSD的发生和蔓延。