几种鲤科鱼类骨骼标本的制作方法总结

鱼类骨骼埋藏在肌肉中，起到维持鱼类体型并保护内脏器官的作用，其形态、骨骼之间的关系相对固定，不易受外界环境的影响，因此骨骼标本在研究鱼类的形态特征演化趋势、对生境的适应性及分类地位的确定具有重要作用[1-2]。同时，骨骼标本能够提供直观、真实的形态学素材，在实验教学中也具有重大意义，也可以用于陈列和展览[3-4]。现有文献中有很多关于骨骼标本制作的研究，大体可分为两类：一类是透明骨骼的制作方法，即利用物理和化学方法使软组织和透明剂的折光率相近从而使软组织透明，骨组织和特殊处理的组织由于染色而被显现[5-6]。另一类是利用物理和化学方法或生物学方法去除肌肉保留完整骨骼的方法。此类方法还可细分为三种：一是热剔法[7]，二是冷剔法[8-11]，三是生物学方法[12-14]。此类方法肌肉剔除方法难以掌握，虽关于研究第二类方法的文献很多，但都存在剔除肌肉步骤叙述不详细的缺点[7-11]，并且对于某些较难处理部位，如咽颅并未进一步详细叙述，给初学者造成了很大的不便。为制作用于本科教学的鱼类骨骼标本，通过对多次来源于新鲜标本及甲醛固定标本的鲤科鱼类标本骨骼制作摸索，本文总结出一套较为详细、简便的骨骼标本制作方法，以期对鲤科鱼类骨骼标本的制作具有参考价值。

1 材料

1.1 实验材料

新鲜鲫、鲤、草鱼，体型正常，体重分别为0.5 kg(鲫)、3.5～4 kg（鲤），4～5 kg（草鱼）。 购自新乡市北环水产市场。甲醛固定标本拉氏大吻鱥Rhynchocypris lagowskii、尖头大吻鱥 Rhynchocypris oxycephalus，体型正常，体长 115～130 mm，体重 20～45 g，采自太行山区。

1.2 实验器材

解剖刀、手术剪刀、手术镊子、解剖针、漂骨缸等。

1.3 实验试剂

0.5%～1%的NaOH溶液（质量-体积浓度）、95%的乙醇溶液（体积百分浓度）、3%～5%的H2O2（体积百分浓度）。

2 制作方法

2.1 标本清洗

2.1.1 甲醛标本

将甲醛固定标本用流水冲洗，直到无刺激性气味为止。

2.1.2 新鲜标本

将新鲜标本表面污渍用水清洗干净，体表粘液用毛巾擦拭去除。

2.2 生物学指标测定

对甲醛标本及新鲜标本进行生物学指标测量，测量其体重、体长、全长等，做好记录，以便估算试剂用量和评估制作效果。

2.3 皮肤剥离、内脏去除

2.3.1 甲醛标本

从实验鱼背部中间枕骨大孔处向尾鳍方向用解剖刀轻轻划开皮肤，注意避开背鳍，再在各鳍处紧贴着鱼鳍四周划开皮肤，然后用镊子和解剖刀从背部向腹部、头部向尾部剥离皮肤，剥到各鳍处时需小心剥离。之后，将腹鳍及其腰带一同剪下，待后期处理。然后沿腹部正中线剪开至肩带后1 cm左右，清除全部内脏，用水冲洗干净。

2.3.2 新鲜标本

活鱼需要做窒息处理，之后将鱼鳞用刀刮掉，用毛巾擦净鱼体表面粘液，然后进行皮肤剥离、内脏去除，方法同2.3.1。

2.4 取咽颅

甲醛标本与新鲜标本取咽颅步骤相同，步骤如下：沿着下颌中线和鳃盖边缘将各连接处结缔组织剪开，将基舌骨暴露，因舌弓不易被发现，用镊子将基舌骨向上撬起直到露出两侧的下舌骨，即可发现有鳃条骨通过系膜与其相连，用镊子将系膜与其分离，分离后将下舌骨、角舌骨表面的系膜剥离，即可发现角舌骨与茎舌骨连接处与鳃盖内侧一凹窝形成关节并通过系膜相连，将此处内外系膜与鳃盖分离即可将舌弓与鳃盖连接处完全分开。尾舌骨埋藏于峡部与喉部，将此处肌肉用镊子轻轻剥离将尾舌骨暴露后，沿尾舌骨边缘将喉部剪断，喉部内侧仍有肌肉与咽颅相连，将其与咽颅分离。肩带上的匙骨内侧与咽颅的咽骨有肌肉相连，将其匙骨内侧肌肉剪断后咽颅上部已可游离。再次将基舌骨向上撬起，可发现其腹面的口咽腔底壁，将其全部清除，即可发现咽鳃骨附在角质垫周围，将咽鳃骨从角质垫附近轻轻分离，甲醛样本分离时，因角质垫极易脱落，需小心分离，分离后咽颅两侧仍有肌肉相连，再将其剪断，至此咽颅底部也可游离，然后将咽颅取出待后期处理。

2.5 粗剔

2.5.1 甲醛标本

先从背部剔除体侧表层大侧肌直到暴露肋骨，然后再剔除肋骨处肌肉。肋骨处肌肉按照肋骨方向用镊子撕下，肋骨基部的肌肉较容易剔除，尽量将其去除干净。其它部分按照肌肉的纹理方向或反其方向剥离肌肉，除肋骨基部肌肉不易剔下其它处肌肉较易剔除，粗剔时即可完全剔除，髓棘和脉棘间仅剩系膜相连。脊柱两侧的肌肉竖直向下或向上即可将脊椎上肌肉完全剔除，处理时尽可能按照肌肉纹理走向，注意用力得当，尽量整块剔除肌肉。将不和脊柱相连的肌间骨一并去掉，各鳍及其支鳍骨先不处理，待细剔时处理。注意开始剥离肉后不要使肌肉沾水，否则会增加剔除难度。

2.5.2 新鲜标本

先从背部剔除体侧表层大侧肌直到暴露肋骨，然后再剔除肋骨处肌肉。沿着脊柱轻轻将肌肉划开成两部分。肋骨表面肌肉顺其肋骨方向用镊子轻轻撕下，粗剔时肋骨游离端肌肉剔除得越薄越好。新鲜标本肋骨特别前两根肋骨极易与脊柱分离，肋骨基部肌肉先轻轻剔除薄薄一层即可，剔除时应十分小心。剔除其它部分肌肉先用解剖刀竖直划开几道，然后用镊子沿着划开的刀口竖直向下或向上大块剥离肌肉即可清晰看见脉棘和髓棘。

2.6 细剔

2.6.1 甲醛标本

继续将肋骨上的肌肉用镊子或解剖刀将其剔薄，将各肋骨间的肌肉剔除，或用剪刀剪开，分开后单独处理每根肋骨。单独处理一根肋骨时用两把镊子，一把夹住肋骨基部一侧，另一把从该处夹住肋骨向游离端轻轻剥离肌肉，剥离到最后1 cm处因其逐渐变细游离端肋骨容易断裂，可先将剥离下的肌肉与肋骨分离，再用两把镊子按照上述方法将最后的肌肉去掉。此外也可夹住肋骨游离端向上1 cm处然后用镊子向上剥离，最后1 cm处顺着肋骨方向参照上述方法处理。按照实际情况选其中一种即可将所有肋骨处理干净，处理由16-20枚脊柱的肋骨时，因其更加细小，剔除肌肉时要更加小心。

2.6.2 新鲜标本

新鲜标本肋骨处剔除方法基本相似，但新鲜标本肋骨处肌肉顺肋骨方向较易清除，反肋骨方向不易清除。新鲜标本较大，肋骨较长，用两把镊子剔除肌肉时，镊子相离较近时方便用力，且不易将肋骨折断。除肋骨处的其余肌肉，先后使用解剖刀、镊子顺髓棘、脉棘方向将肉慢慢剔除，至此髓棘与脉棘处仅剩薄薄的一层系膜。

2.7 处理头部、鱼鳍及其支鳍骨

新鲜标本与甲醛固定标本处理方法相同，处理方法如下：将眼窝内充斥的内含物仔细清除。在眼腹面鳃区前有一月牙形肌肉覆盖在皮肤和前鳃盖骨之间即下颌收肌，沿肌肉下边缘将皮肤划开，将其底部肌肉剔除干净。因围眶骨系骨片较小容易被破坏，因此保留此处皮肤，不予剥离。除此处皮肤外需将头部其它部分皮肤全部剥离，上下颌部分骨骼细小，剔除时应多加小心。鳃盖骨后方肌肉较易清除，将此处肌肉清除后再将脑颅内含物用水冲洗干净，若冲洗不掉再用镊子小心剔除，头部骨骼即清理完成。处理胸鳍及肩带时，肌肉较易清除，但需小心不要将两肩带连接处弄断。臀鳍以及背鳍支鳍骨处的肌肉按照支鳍骨着生方向先用镊子剥离大块肌肉，不易用镊子剔除部分再用解剖针仔细剔除，保留较薄结缔组织层保持连接即可。尾鳍部尾杆骨肌肉较易去除，参照上述支鳍骨处肌肉剔除方法小心剔除即可。

2.8 处理咽颅及腹鳍、腰带

2.8.1 甲醛标本

咽颅先用水清洗干净血污与食物残渣。首先用镊子将鳃丝从鳃弓上剥离，甲醛标本鳃丝较易剥离。若咽颅背部有口腔顶壁覆盖，首先将口腔顶壁从上向下剥离至第四基鳃骨后端，再沿着咽鳃骨向上鳃骨处剥离，剥离过上鳃骨和角鳃骨连接处，接着再从上向下去除，甲醛固定引起标本组织皱缩，故口腔顶壁与鳃弓紧密相连不易清除。因此处极易破坏鳃弓，需小心剥离。位于第五对左右角鳃骨和下咽骨之间有一大片扁平的肌肉即腹面后横肌和食道前端，用剪刀镊子将此处肌肉分离后即可暴露咽齿。然后处理咽齿，咽齿处肌肉用镊子沿着咽齿着生方向剥离，虽咽齿较坚固但也要小心处理,防止处理不当造成咽齿脱落。口腔顶壁去除后，基鳃骨与下鳃骨表面仍有口腔底皮和细小肌肉覆盖，因口腔底皮皱缩后与肌肉、骨骼紧密相连，且此处骨骼细小，需用小号镊子小心去除，第五对鳃弓借韧带连接于第四基鳃骨后端，去除时为保证咽颅的完整性，此处肌肉不剔除。咽鳃骨内外表面仍有细小肌肉，需用小号镊子小心剔除，至此咽颅已处理完成。腰带处肌肉较易处理，沿肌肉纤维走向小心剥离处理，保留腰带骨骼即可。

2.8.2 新鲜样本

咽颅先用水清洗干净血污与食物残渣。新鲜标本的鳃丝柔软，处理鳃丝时需一把镊子夹住鳃弓，再用另一把镊子一点一点的将鳃丝剥离。因新鲜标本口腔底壁较柔软未皱缩，取咽颅时即可清理干净，若未清除干净用镊子小心剥离即可。其它部分处理方法参照甲醛标本处理方法。但处理咽齿时，因新鲜鱼肌肉具有粘性，咽齿间肌肉不易去除，咽齿间的肌肉则需用解剖针逐一剔除，此处未剔除干净的肌肉，可用NaOH溶液浸泡腐蚀后再进一步剔除。

2.9 腐蚀肌肉

后续步骤中新鲜标本与甲醛固定标本处理过程一致。将剔过的标本浸入0.5%～1%的NaOH溶液中，浸泡10～12 h，处理时间根据鱼体大小做适当调整，浸泡期间需定期检查骨骼之间连接状态，防止浸泡过度造成骨骼间结缔组织被腐蚀变成散骨。浸泡结束后用清水轻轻冲去残留NaOH溶液，NaOH溶液冲洗干净后若仍有未剔除干净肌肉可再次剔除。在细剔时保留的棘间系膜经NaOH溶液腐蚀后变得透明柔软，用镊子小心剔除即可。

2.10 脱脂

将用NaOH溶液处理过的骨骼放入已准备好的95%的乙醇溶液中浸泡30 min，根据实际情况时间可适当延长直至骨骼标本表面无残留油脂。

2.11 漂白

放入盛有3%-5%H2O2溶液的漂骨缸内，直到骨骼透明为止。因H2O2溶液具有氧化性，至骨骼变白时需及时将其拿出，否则会使骨骼软化甚至散架。腐蚀肌肉、脱脂、漂白三个过程均将骨骼标本自然放置，避免使其弯曲。

2.12 整形装架

漂白后将骨骼拿出，若骨骼弯曲，取长度大于骨骼总长1/3的光滑直径适宜的木棍，将木棍穿过其口并用尼龙线将其固定在鱼的脊柱处，使脊柱呈自然的状态。待骨骼干燥后，置于骨架台上即可。

3 结果及其讨论

甲醛固定标本与新鲜标本的骨骼标本制作各有优缺点。甲醛固定标本肌肉、鳃丝较易剔除，但因被甲醛浸泡过，骨骼变得硬，柔韧性变差，在取咽颅时极易使鳃条骨断裂，因此取咽颅时需细致小心，同时甲醛标本口腔底壁因皱缩不易去除极易破坏鳃弓。新鲜标本肌肉、鳃丝因新鲜具粘性剔除较甲醛固定标本难度稍有增大，但因其骨骼灵活性大，取咽颅时不易损坏其它部位。同时，在骨骼标本制作完成后，从外观形态而言，新鲜标本更为美观。本文采用的方法较透明骨骼的制作方法相比，透明骨骼的制作方法可以在保持标本外形完整的情况下显示出体内骨骼部分,显示出生物体的骨骼发育情况[6]，但存在耗时久、耗材多、褪色步骤难以掌握、易受实验环境的温度、动物体质量、动物年龄和碱性试剂浓度等因素影响等缺点[15-18]。本文采用的方法用时短且容易控制、耗材少，标本更加清晰美观。与同类方法中的热剔法而言，处理时间较易控制，热剔法中时间难以控制，时间较长骨骼容易散架，时间较短肌肉组织较难剥离，且高温会使鳍条间的蛋白质变性，各骨骼间相连的韧带将被破坏而易变为散骨，鱼类骨骼数目多且骨片小，散架后人为连接很难成功[10]。而本实验采用的方法各鳍条及支鳍骨可保存完好。本实验较生物法能够人为控制，且实验时间不受限制，生物法利用生物啃食肌肉的方法，存在骨骼易被误食、耗时时间无法控制、制作时间受受试生物影响、骨骼标本不美观等缺点[12-14]。但本实验剔除肌肉需熟练掌握后才能制作出较理想的标本更加行之有效的方法需进一步摸索。

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