鱼类细菌性疫苗的研究进展

随着我国水产养殖业高密度、规模化、集约化高速发展，病害已成为产业健康可持续发展的重大挑战。目前来看，对水产养殖鱼类使用疫苗，是最理想的疫病防控手段，既可以防控鱼类病害发生，减少产业的经济损失，又可以减少或消除由于大量使用抗生素带来的健康危害、生态风险和水产品食品安全等问题，从而支撑水产养殖业健康、绿色发展。现介绍目前鱼类细菌性疫苗的具体制备方法、免疫方法、评价体系和开发存在的问题，旨在从根本上提高鱼体的免疫力，减少病害发生频率，以获得最大经济效益。

1 我国鱼类细菌性疫苗的研究现状

20 世纪40 年代开始，欧美等发达国家开展了鱼类疫苗的研究[1]。鱼类疫苗包括细菌疫苗、病毒疫苗和寄生虫疫苗。其中，细菌疫苗由灭活或减毒活菌制成，用于主动免疫接种。相比于病毒疫苗和寄生虫疫苗，细菌疫苗的研制方法相对简单、应用相对广泛，但大多数疫苗仅停留在试验阶段，大规模商用较少。

20 世纪60 年代末，我国首个鱼用疫苗——草鱼出血病组织浆灭活疫苗研制成功。2002 年，李爱华等[2]研制了淡水鱼类出血性致病菌嗜水气单胞菌和河弧菌的二联疫苗。2006 年，曹宏梅等[3]研制了海水鱼类致病菌鳗弧菌和溶藻弧菌的二联疫苗，发现二联疫苗免疫对大菱鲆（Scophthalmus maximus）鳗弧菌和溶藻弧菌的免疫保护率分别为83.52%和83.24%。2009 年，潘燕华等[4]用肌内注射和浸泡免疫方式，分析鳗弧菌减毒活疫苗对牙鲆（Paralichthys olivaceus）的免疫保护作用，发现注射或浸泡减毒活疫苗的牙鲆的免疫保护率达到100%，明显高于灭活疫苗的60%。随着基因工程技术的应用，2014 年，庞欢瑛等[5]构建了溶藻弧菌vscO基因缺失的减毒活疫苗ZJ03ΔvscO，可有效提高石斑鱼对溶藻弧菌的免疫力。

2 制备与检测

2.1 制备

2.1.1 菌液的培养

选取毒力较强、已经确定保藏的菌种，将其接种于琼脂平皿，在菌种的最适生长温度（不同的细菌最适生长温度不同，一般28~30 ℃）下培养24 h，生产出菌落，挑取适量单菌落，接种于液体培养基，在最适生长温度下，震荡培养24 h，得到菌液。

2.1.2 菌液检验

于无菌条件下，取少量菌液，滴加到培养基表面，将菌液均匀涂布于培养基表面，在最适生长温度下培养24 h，观察细菌的生长情况，要求无杂菌生长。

2.1.3 菌含量测定

平板计数测定，将菌液稀释后，用分光光度法测定细菌的吸光度（OD 值），计算细菌浓度，菌液浓度≥50×108cfu/mL。

2.1.4 菌液灭活

采用化学灭活和热灭活2 种方法。化学灭活法多使用甲醛、苯酚和三氯甲烷溶液。热灭活法多使用60 或65 ℃水浴法。后进行分装，石蜡封口，贴标签，即可制成灭活菌苗。

2.2 检测

2.2.1 无菌检验

将灭活的菌苗经28 ℃培养，设2 个平行，24 h后，检查有无菌落形成。如果所接平板均无菌落生长，说明疫苗中无活菌存在。

2.2.2 安全性检验

将灭活的菌苗浓度稀释至5×108cfu/mL，对20 尾健康活鱼的腹部注射，剂量为0.2~0.5 mL/尾。正常投喂14 d，同时设置空白对照组，观察鱼体反应。如果接种鱼其运动、摄食等活动无异常，成活率为100%，说明所制备的疫苗安全。

2.2.3 相对免疫保护率测定

取上述菌苗，对同规格20~40 尾活鱼注射，剂量为0.2~0.5 mL/尾。投喂30~60 d 后捕捞，用同源强毒株菌种攻毒，攻毒后，正常喂养7 d，统计死亡率。若浸泡免疫的保护率为70%以上、注射免疫保护率为80%以上，则为合格疫苗。相对免疫保护率计算公式为：相对免疫保护率（%）=(对照组平均死亡率-免疫组平均死亡率）/对照组平均死亡率×100%

3 免疫方法

免疫方法主要有浸泡免疫、注射免疫和口服3 种。

3.1 浸泡免疫

浸泡免疫是将疫苗配成适当浓度，加到水体中，鱼体通过鳃和体表黏膜的吸收进行免疫。其优点是对鱼体创伤小，有利于水生动物群体免疫。可通过优化氯化钠浸泡液浓度、浸泡时间和温度等免疫条件，提高浸泡免疫效果。蒋昕彧等[6]采用超声波辅助浸泡法，导入草鱼嗜水气单胞菌疫苗，相比单纯浸浴法，可获得较好的免疫保护效果。

3.2 注射免疫

注射免疫是将疫苗直接注入鱼体内，其所需疫苗量少，受环境影响小。张丽等[7]以浸泡和注射2 种免疫方法，用迟缓爱德华氏菌对养殖大菱鲆进行全菌疫苗免疫，发现注射和浸泡接种2 种方法，均使大菱鲆对腹水病产生免疫效果，且注射免疫效果优于浸泡免疫。2019 年，洪杨等[8]设计了一种鱼类疫苗自动注射设备，可有效提高注射作业效率，降低人工接种强度，有利于鱼苗注射接种技术的推广。

3.3 口服免疫

口服免疫是将疫苗添加到饲料中，通过口服进行免疫。鱼用疫苗最理想的接种途径，是把疫苗混合到饵料中进行口服免疫，但其免疫效果远不及注射法和浸浴免疫，主要原因是鱼吸收疫苗前，胃内的消化酶已将疫苗分解。因此，边慧慧等[9]将鳗弧菌灭活疫苗制备成微囊口服疫苗，对牙鲆进行免疫，发现其免疫效果优于普通口服疫苗。

4 鱼类免疫佐剂

免疫佐剂是指能非特异增强抗原的免疫原性或改变免疫应答类型的物质。按照来源，可分为动植物提取物（蜂胶、皂角苷、甘草素）、微生物类衍生物（葡聚糖、肽聚糖、脂多糖）、人工合成的有机物和无机盐（铝盐）、生物活性分子类（细胞类因子CK）等。张念慈等[10]通过试验证明，只要在疫苗中加入少量莨菪碱，即可明显增强疫苗的浸泡免疫效果。韩雯等[11]用皂角苷浸泡大菱鲆，证明皂角苷具有提高鱼类非特异免疫效果。任燕等[12]研究发现，蓖麻油聚乙二醇单酯葡萄糖苷，可提高异育银鲫嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫效果。

5 疫苗效果评价方法

由于鱼种、环境等差异，目前还没有统一的鱼用疫苗效果评价方法。疫苗效果评价指标分为非特异性免疫评价指标、特异性免疫评价指标和相对免疫保护率。非特异性免疫评价指标有溶菌酶活性、超氧化物歧化酶活性、血清抑菌活性、外周白细胞数量变化、外周红细胞数量变化和非特异性免疫相关基因的表达量（补体系统中C3、补体C4 基因表达量、细胞因子基因表达量变化）等；特异性免疫评价指标有血清抗体效价、主要组织相容性复合体基因表达量变化。相对免疫保护率是在免疫试验后进行攻毒试验，统计免疫组和对照组的死亡率，计算相对免疫保护率，它更直接地表明疫苗免疫效果。相对免疫保护率越高，表示疫苗免疫效果越好。

在评价疫苗效果时，可选取1 个或多个敏感指标进行评价。隋虎辰等[13]用添加多糖佐剂的迟缓爱德华氏菌灭活疫苗，来免疫大菱鲆。通过测定血清中溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力、血清抗体效价和相对免疫保护率4 个指标，评价各疫苗组的免疫效果。刁菁等[14]通过检测牙鲆抗体效价、6 种免疫相关基因表达变化及相对免疫保护力指标，对脂多糖和酵母β 葡聚糖的免疫保护效果进行评价。

6 疫苗开发存在的问题

6.1 思想保守，疫苗使用率低

部分水产养殖从业人员缺乏防病意识，在水产养殖中不愿意投入较多的资金进行疫苗免疫。发生病害时，养殖人员也倾向于使用价格较低的抗生素类药物治疗，导致大量耐药菌出现，造成药物残留，对食品安全及人类健康造成重大威胁。

6.2 疫苗研发成本较高，商业疫苗开发少

我国鱼类养殖品种较多，病害类型及病原也不同，其免疫系统对不同病害的抵抗力和感受性不同，因此适用疫苗也不同，增加了疫苗研发成本。此外，目前疫苗审核需要临床试验，而自发使用疫苗的养殖从业人员较少，试验基地养殖鱼类的品种和数量，均无法满足细菌性疫苗临床试验需求。若将疫苗免费发放，既增加了研发成本，又承担了极大风险，使得企业研发商业疫苗的积极性不高。

6.3 影响免疫应答的因素较多

影响免疫应答的因素较多。首先，鱼的年龄和体质量、性别、营养状况、生理状态和群体效应等，均影响免疫应答，体格强壮的鱼免疫机能旺盛，鱼处于应激状况下免疫应答会受到影响。其次，抗原的剂量和进入机体途径均显著影响免疫应答。再次，温度对鱼类免疫应答的影响也很大。当环境温度高于免疫临界温度时，鱼类才能产生免疫应答，而且在适宜的生长温度内，温度越高，免疫应答越快。最后，除温度外，季节、光周期、可溶性污染物及药物、佐剂的选择也影响免疫效果。

7 建议

7.1 加大推广宣传力度

建议科研院所、高校、渔业技术推广机构借助网络、媒体等平台，推广疫苗防病技术，增强养殖者的环境保护和水产品质量安全意识，提高其健康养殖水平，使鱼用疫苗逐步替代药物，实现健康养殖。

7.2 简化审批手续

鱼用疫苗审批是一个复杂的系统工程，需要科研机构与养殖企业相互合作。建议简化疫苗审批手续，加快鱼用疫苗成果快速向产业端转化。

7.3 研究方向

目前，我国已经建立了灭活疫苗、减毒活疫苗等成熟的渔用疫苗技术开发路线，并成功开发了渔用疫苗产品[15]。在此基础上，构建以疫苗接种为核心的水产病害免疫综合防控体系，是今后鱼类疫苗研究工作中的主要方向。通过加强对病原的血清学和流行规律、佐剂、免疫增强剂、抗原载体、疫苗体外评估系统、疫苗自动化接种设备等方面的系统研究，形成完备的鱼类病害免疫综合防控体系，推进我国鱼类多联、高效疫苗的开发和应用。此外，还需加强重点鱼品种主要疫苗的全覆盖接种工作。