简介

本实验来源于：动物细胞培养——基本技术指南（第五版）

操作方法

一、成纤维细胞饲养层

原理

通过用链酶蛋白酶除去绒毛膜、用添加成分的FGF培养液培养细胞和采用不同的胰蛋白酶消化筛选成纤维细胞，用原肠胚期斑马龟的胚胎成纤维细胞制备饲养层[Sun et al.,1995a]。

材料与仪器

链酶蛋白酶E用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA受精后8h的胚胎FBS LDF基础培养液LDF原代培养液LDF维持培养液D培养液Holtfreter缓冲液 培养瓶

步骤

鳟鱼胚胎提取物：
(a)收集胚胎（受精后28天的Shasta Rainbow或其他鳟鱼种系，在10°C条件下饲养，或者受精后3天的斑马鱼，在28°C条件下饲养），在-80°C条件下冻存
(b)为了制备提取物，将约150 g胚胎融化后，采用Tissuemizer匀浆器（Tekmar)用10 ml LDF在冰上匀浆2 min
(c)将匀浆通过数层纱布过滤后去除绒毛膜，然后在4°C条件下离心（20000 g，30 min)
(d)离心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂层
(e)将上清液移入1只新离心管，按操作步骤（c)离心
(f)收集上清液，留下剩余的脂质，然后在4°C条件下超速离心（100000 g，60 min)
(g)超速离心后收集上清液，留下脂层。用LDF(1:10)稀释上清液，然后过滤除菌
(h)提取物过一系列滤器（1.2μm、0.45μm和0.2μm)过滤
(i)将提取物按0.5 ml分装后，在-80°C条件下冻存
(j)为了用提取物培养细胞，测量蛋白质浓度（见方案21.4)，然后用LDF将提取物稀释至理想的工作浓度
(k)将稀释的提取物在4°C条件下冷藏，最长2个月BRL细胞条件培养液：
(a)在37°C条件下和在75 cm2培养瓶中，用DMEM/F12/10FB培养液培养BRL细胞（ATCC)
(b)当细胞汇合时，用添加2%FBS的LDF置换FD培养液，在37°C条件下培养
(c)5天后吸出LDF，过滤，在-20°C冻存
(d)向细胞中加入新鲜的LDF，5天后重复此过程。条件化的LDF培养液可从同一个培养瓶中收集3次。然后，将细胞分开培养，使细胞再次汇合
1.收集约30个受精后8 h的胚胎。
2.通过链酶蛋白酶处理，除去绒毛膜[Sun et al.，1995a]。
3.用胰蛋白酶孵育胚胎1 min，同时用吸管轻轻吹打，以便使细胞分散。
4.加入FBS(终浓度为10%)，终止胰蛋白酶的消化。
5.离心（500 g，10 min)，收集细胞。
6.用5 ml含有PGF的LDF原代培养液混悬细胞，然后将细胞移入25 cm2培养瓶。
7.在26°C条件下，让细胞贴壁和汇合。
8.当细胞汇合时，用同样的培养液传代。
9.培养2~3代后，上皮细胞和成纤维细胞将混合出现。这些细胞可用含有10%FBS的LDF基础培养液维持培养。通过不同的胰蛋白酶消化，为下一步培养筛选成纤维细胞。
(a)用胰蛋白酶处理细胞1 min以除去大部分成纤维细胞，保留贴在瓶壁上的上皮细胞。
(b)将成纤维细胞移入另1个培养瓶。当细胞汇合时，重复以上过程。
(c)培养2~3代后，细胞均为成纤维细胞。
10.制备生长抑制的成纤维细胞饲养层：
(a)将细胞加入合适的培养皿或培养瓶，使成纤维细胞生长成为汇合的单层。
(b)将10μg/ml丝裂霉素C加入成纤维细胞中，在26°C条件下处理3 h。
(c)用LDF浸洗3次后，可将生长抑制的成纤维细胞用作斑马鱼胚细胞培养的伺养层。

二、原代培养（斑马鱼胚胎细胞的培养）

原理

收集胚胎，除去绒毛膜，用胰蛋白酶分散胚胎细胞，然后在胚胎成纤维细胞饲养层上培养从斑马鱼囊胚和原肠期胚获得的原代细胞。

材料与仪器

链酶蛋白酶E用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA胚胎成纤维细胞饲养层人重组白血病抑制因子 漂白剂
LDF基础培养液LDF原代培养液LDF维持培养液D培养液Holtfreter缓冲液稀

步骤

鳟鱼胚胎提取物：
(a)收集胚胎（受精后28天的Shasta Rainbow或其他鳟鱼种系，在10°C条件下饲养，或者受精后3天的斑马鱼，在28°C条件下饲养），在-80°C条件下冻存
(b)为了制备提取物，将约150 g胚胎融化后，采用Tissuemizer匀浆器（Tekmar)用10 ml LDF在冰上匀浆2 min
(c)将匀浆通过数层纱布过滤后去除绒毛膜，然后在4°C条件下离心（20000 g，30 min)
(d)离心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂层
(e)将上清液移入1只新离心管，按操作步骤（c)离心
(f)收集上清液，留下剩余的脂质，然后在4°C条件下超速离心（100000 g，60 min)
(g)超速离心后收集上清液，留下脂层。用LDF(1:10)稀释上清液，然后过滤除菌
(h)提取物过一系列滤器（1.2μm、0.45μm和0.2μm)过滤
(i)将提取物按0.5 ml分装后，在-80°C条件下冻存
(j)为了用提取物培养细胞，测量蛋白质浓度（见方案21.4)，然后用LDF将提取物稀释至理想的工作浓度
(k)将稀释的提取物在4°C条件下冷藏，最长2个月
BRL细胞条件培养液：
(a)在37°C条件下和在75 cm2培养瓶中，用DMEM/F12/10FB培养液培养BRL细胞（ATCC)
(b)当细胞汇合时，用添加2%FBS的LDF置换FD培养液，在37°C条件下培养
(c)5天后吸出LDF，过滤，在-20°C冻存
(d)向细胞中加入新鲜的LDF，5天后重复此过程。条件化的LDF培养液可从同一个培养瓶中收集3次。然后，将细胞分开培养，使细胞再次汇合
1.在中襄胚或早原肠胚期收集胚胎，用清洁水浸洗数次。
2.浸洗后将胚胎移入60 mm皮氏皿(50~100个/皿）。然后，将皮氏皿放入层流通风橱中，在无菌条件下放置。
3.将胚胎放入稀漂白剂中浸泡2 min，然后用无菌的Holtfreter缓冲液浸洗数次。
4.用2 ml链酶蛋白酶E溶液孵育10 min，使胚胎去绒毛膜。然后，将胚胎在皮氏皿中轻轻搅动，使胚胎与部分消化的绒毛膜分离。
5.将培养皿倾斜，以便从一侧收集胚胎，用巴斯德吸管轻轻吸出1.5 ml链酶蛋白酶溶液。为了防止去绒毛膜的胚胎黏附在皮氏皿上和破裂，保持皮氏皿倾斜，以便胚胎悬浮在剩余的链酶蛋白酶溶液中。
6.加入2 ml Holtfreter缓冲液，轻轻搅动，以便轻轻浸洗胚胎。
7.将皮氏皿倾斜，吸去大部分Holtfreter缓冲液，将胚胎悬浮在约0.5 ml缓冲液中。
8.重复浸洗步骤两次以上。
9.在最后1次浸洗后，将胚胎悬浮在0.5 ml Holtfreter缓冲液中，然后加入2 ml胰蛋白酶溶液。
10.用胰蛋白酶将胚胎孵育1 min，然后通过用吸管轻轻吹打3~4次分离细胞。
11.将细胞悬液立即移入无菌的聚丙烯离心管中，然后加入200μl FBS，以终止胰蛋白酶的消化作用。
12.通过离心（500 g，5 min)收集细胞，然后用无FBS或鳟鱼血清的LDF原代培养液混悬细胞。
13.将细胞以1×104个/cm2的细胞密度种植到含有生长抑制的成纤维细胞饲养层的多孔培养板或培养瓶中。
14.在加入FBS或鳟鱼血清前让细胞附着于饲养层（约15 min)。在培养液中使用10 ng/ml人重组LIF，此优于BRL条件培养液[Sun et al.，1995a，1995b]。

三、细胞系

材料与仪器

链酶蛋白酶E用D-PBSA配制1%胰蛋白酶和1mmol L EDTA ZEM-2细胞（或等同物）LDF基础培养液LDF原代培养液LDF维持培养液D培养液Holtfreter缓冲液

步骤

鳟鱼胚胎提取物：
(a)收集胚胎（受精后28天的Shasta Rainbow或其他鳟鱼种系，在10°C条件下饲养，或者受精后3天的斑马鱼，在28°C条件下饲养），在-80°C条件下冻存
(b)为了制备提取物，将约150 g胚胎融化后，采用Tissuemizer匀浆器（Tekmar)用10 ml LDF在冰上匀浆2 min
(c)将匀浆通过数层纱布过滤后去除绒毛膜，然后在4°C条件下离心（20000 g，30 min)
(d)离心后收集上清液，留下表面的亮橘色脂层
(e)将上清液移入1只新离心管，按操作步骤（c)离心
(f)收集上清液，留下剩余的脂质，然后在4°C条件下超速离心（100000 g，60 min)
(g)超速离心后收集上清液，留下脂层。用LDF(1:10)稀释上清液，然后过滤除菌
(h)提取物过一系列滤器（1.2μm、0.45μm和0.2μm)过滤
(i)将提取物按0.5 ml分装后，在-80°C条件下冻存
(j)为了用提取物培养细胞，测量蛋白质浓度（见方案21.4)，然后用LDF将提取物稀释至理想的工作浓度
(k)将稀释的提取物在4°C条件下冷藏，最长2个月BRL细胞条件培养液：
(a)在37°C条件下和在75 cm2培养瓶中，用DMEM/F12/10FB培养液培养BRL细胞（ATCC)
(b)当细胞汇合时，用添加2%FBS的LDF置换FD培养液，在37°C条件下培养
(c)5天后吸出LDF，过滤，在-20°C冻存
(d)向细胞中加入新鲜的LDF，5天后重复此过程。条件化的LDF培养液可从同

一个培养瓶中收集3次。然后，将细胞分开培养，使细胞再次汇合
1.用LDF维持培养液培养从早期斑马鱼胚胎获得的细胞如ZEM-2，至约70%汇合。
2.在26°C和环绕空气的条件下培养细胞。
3.约每5天换培养液1次。
4.经胰蛋白酶消化，继代培养。
已表明鳟鱼血清和胚胎提取物剌激其他鱼类胚细胞的生长[Cdlodi and Bames,1990]。