虾类肝肠胞虫流行病学研究进展

虾类肝肠胞虫流行病学研究进展

胡吉卉，李正民，段健诚，高焕

（1. 江苏海洋大学海洋科学与水产学院，江苏省海洋生物技术重点实验室；江苏 连云港 222005；2. 江苏省农业种质资源保护与利用平台，江苏 南京 210014）

虾肝肠胞虫（Enterocytozoon hepatopenaei, EHP）隶属于微孢子虫科（Microsporidia）、肠胞虫属（Enterocytozoon），成熟的孢子大小为（0.9±0.3）μm×（1.8±0.3）μm，呈椭圆形[1－2]。2003 年在泰国养殖的斑节对虾（Penaeus monodon）中发现，2009 年被成功分离，并被定义为孢子虫属的一个新物种[3]。

肝肠胞虫作为一种专性细胞内寄生虫，主要寄生在虾类肝胰腺肝小管上皮细胞内，且具有高度传染性。凡纳滨对虾（P. vannamei）、脊尾白虾（Palaemon carincauda）和斑节对虾（P. monodon）等主要经济养殖虾类都是其主要感染对象，感染后会造成虾类生长缓慢或停滞，是影响全球虾类养殖生产的重要病原之一[4－5]。该文总结了国内外现有的研究成果，重点介绍了肝肠胞虫在流行情况、病理症状、致病机理、传播途径、检测方法和防治措施等方面的研究进展，以期为肝肠胞虫的病害防治提供指导帮助。

1 流行情况

自2003 年被发现以来，中国、印度、委内瑞拉、马来西亚、印度尼西亚等多个国家都有EHP 检出的相关报道[6]。从2013 年开始，我国多个省市的虾类养殖基地先后发现了EHP 感染，并且感染率呈上涨趋势。2015 年上半年，浙江省水产技术推广站检测了70 多个苗种场的134 份南美白对虾虾苗样品，结果发现EHP 的检出率达53.8%[7]；同年5—9 月，舟山地区270 份凡纳滨对虾样本中，EHP 的检出率高达85.19%[8]。2015—2017 年天津市虾肝肠胞虫的流行情况调查显示，当地养殖虾类中存在不同程度的EHP 感染，2015 年和2016 年EHP 的检出率分别为56.96%、69.52%[9]。2019 年江苏省温室池塘养殖虾类中EHP 的患病率为56.3%，而土塘养殖虾类中EHP 的患病率则达到了79.5%[10]。由此可见，EHP 引发的感染病已经严重危害了我国虾类养殖业。

2 病理症状

EHP 会使养殖虾类感染肝胰腺微孢子虫病（Hepatopancreatic microsporidiosis, HPM），感染后没有明显的临床症状，摄食正常，肠道饱满，没有大批量死亡。2～3 个月后病虾表现为生长速度缓慢甚至停止生长，体型大小差异明显，约50%左右的染病虾体质量增长到4～5 g 时再无变化。严重感染时，病虾肠道出现发炎，解剖发现其肝胰腺萎缩病变、发软、颜色变深，少数病虾还会出现白便症状[11]。

取感染虾的血淋巴进行检测，发现其总蛋白量和白蛋白量显著上升，碱性磷酸酶（alkalinephos phatase, ALP）、谷草转氨酶（asparate transaminase,AST）和谷丙转氨酶（alanine transaminase, ALT）等肝损伤指标数值显著高于健康虾[12]。由此可知EHP会引起肝胰腺病变，从而导致肝胰腺功能受损。

3 感染机制

EHP 无法在细胞外进行繁殖，只能寄生在细胞内部，因此其感染方式也比较独特。目前普遍认为极管是EHP 感染宿主细胞的主要细胞器[13]。极管是以螺旋形盘绕在孢子内部的一种管状结构，由极管蛋白组成且具有弹性。当孢子进入宿主体内时，由于外界环境的刺激，孢子内部压力急剧增大，极管外翻并弹出，刺破宿主细胞膜，然后将孢原质注射进宿主细胞内部[14]。孢原质在新的细胞中增殖循环，最终产生新的孢子，从而实现孢子的繁殖和遗传物质的复制[15]。

4 传播途径

传播是寄生虫感染宿主群体并完成生活史的重要环节之一。EHP 的传播有两种途径：水平传播和垂直传播。

4.1 水平传播

大多数微孢子虫都具有致病性，且大多通过水平传播方式感染脊椎和无脊椎宿主[16]。EHP 的水平传播途径相对复杂，既可以通过摄食传播，即健康虾摄食被EHP 污染的饲料或饵料、病死虾残体以及养殖水环境中的孢子体而被感染[17]；也可以通过养殖水体传播，即健康虾生活在含有EHP 孢子的养殖水体中被感染[18]。

4.2 垂直传播

垂直传播是指EHP 通过母体宿主传递到子代宿主，通过宿主的繁殖实现自身传播。2018 年Vukhac等[19]给亲虾投喂已感染的虾组织，在无节幼体中发现了EHP 的感染，第一次证明EHP 可以在凡纳滨虾类中垂直传播，并根据这个结果建立了一种针对虾类幼体EHP 检测的PCR 方法。

5 检测方法

EHP 的检测有多种方法，显微镜技术、细胞培养方法、动物模型等方法都可检测到[20]。但由于EHP个体微小，光学显微镜观察虫体形态的方法很难直接判断，因此常采用组织学或分子生物学方法来对EHP 进行确切的诊断。

5.1 组织学方法

病理检测是目前临床医学最为可靠的一种定性诊断，可通过组织石蜡切片，苏木精-伊红（HE）染色，显微观察，最终发现组织病理变化，准确判断病因[21]。目前常用的组织染色法有HE 染色法、甲苯胺蓝（TB）染色法、Masson 染色法、普鲁士蓝（PB）染色法、爱显蓝-雪夫（AB-PAS）染色法、伟郝夫范吉森（EVG）染色法、劳克坚牢蓝（LFB）染色法和天狼猩红（Sirius red）染色等[1]。常晓晴等[21]对以上8 种染色方法进行比较，综合分析染色效果及检出率，发现Masson 染色法效果最佳。然而，组织学方法检验耗时长，制作流程繁琐，且肝肠胞虫含量低时极易漏诊，因此，现在主要将其用作临床诊断的辅助工具。

5.2 分子生物学方法

与组织学方法相比，分子生物学方法更灵敏、更快速、特异性更强，是目前实验室检测EHP 最常使用的技术手段。目前常用的分子生物学方法主要有普通PCR 检测法、环介导等温扩增技术（Loopmediated isothermal amplification, LAMP）、地高辛标记核酸探针原位杂交法、巢式PCR、实时荧光定量PCR 法等，这些方法在快捷程度和灵敏度上各有优劣。

5.2.1 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术是一种新型核酸扩增技术，具有特异性强、敏感性高、成本低廉的优点。因其操作简单、检测速度快，常用于现场的快速检测。孙妍等[22]比较了LAMP方法和常规PCR 方法在检测EHP 灵敏度方面的差异，发现该方法检出限为3.71 个质粒拷贝/μL，灵敏度是普通PCR 的100 倍。

5.2.2 原位杂交技术（ISH） ISH 是一种比PCR 法灵敏度更高，且可以定位和相对定量检测EHP 的方法。该方法利用核酸分子单链之间互补的碱基序列，将探针与待测DNA 或RNA 结合成专一的核酸杂交分子，经一定手段将其显现出来[23]。Tang 等[24]采用该方法特异性的检出了凡纳滨对虾组织、粪便和养殖水体中存在的EHP。不足的是该方法操作繁琐且费时。

5.2.3 PCR 检测法 普通PCR 方法只进行一次特异性片段的扩增，容易出现假阳性，因此很难准确的判断EHP 感染[25]。巢式PCR 作为一种变异的聚合酶链反应，通过两轮PCR 反应，增强了检测的特异性和敏感度。Amornrat 等[17]扩增了EHP SSU rDNA 基因并且构建了系统进化树，建立了EHP 的一种巢式PCR 检测方法，证明了EHP 不是凡纳滨对虾白便综合征的原因。Jaroenlak 等[25]针对EHP 的胞外蛋白基因进行了鉴定和基因组测序，并以此建立了一种新的巢式PCR 检测方法，即灵敏度更高的SWP-PCR 法。

实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）是利用荧光信号的积累实时监测PCR 进程，然后对未知模板进行定量分析的检测方法。目前已建立的实时荧光定量PCR 方法根据使用所使用的荧光物质不同分为TaqMan 探针法和SYBR Green I 荧光染料法两种，更常用的是操作简单且成本低的SYBR Green I 荧光染料法。骆云慧等[26]建立了灵敏度比常规PCR 高10 倍的TaqMan 实时荧光定量PCR 检测方法，该方法对EHP 标准质粒的检测灵敏度为5.2×102copies/μL，可满足高通量检测。刘珍等[5]优化了荧光定量PCR 反应条件，建立了检测灵敏度比普通巢式PCR 高约4 倍的SYBR Green I 实时荧光定量PCR 检测方法。该方法简单快速且灵敏度高，避免了因样品的代表性和灵敏度而造成的误诊问题。

6 防治措施

EHP 的出现，严重危害着虾类养殖，国内外学者也对其防治措施进行了大量的研究。但由于EHP的严格细胞寄生，其成熟的孢子壁有一层极坚硬的几丁质外壳，外源性药物很难见效，目前还未发现有效的治疗药物[27]。因此对于EHP 的防治应“防重于治，防治结合”双管齐下，根据实际情况，对养殖过程中的每一个可能感染EHP 的环节做好风险防控，多方面实施预防手段，进而减少EHP 的感染。

6.1 严格的清塘处理

有机质丰富的池塘会给EHP 的中间宿主提供适宜的生存环境，因此在放苗前，要对池塘进行彻底的清塘处理，尤其是曾经感染过EHP 的养殖池溏。处理方式包括对池塘底泥进行翻耕，并用氢氧化钠、生石灰等强碱性物质对塘底消毒，从而破坏大部分微孢子虫适宜的生存环境，排除虾EHP 存在的隐患[20]。

6.2 育苗生物安全

选择优质的虾苗进行繁殖和培育，繁殖前要进行严格且正规的检测。培育亲虾的培育池及日常养殖使用的工具，在正式使用之前要确保清洁干净。做好池塘的清淤消毒，之后还要进行干燥处理。以上措施虽不能完全消灭EHP，但可以降低EHP 的数量水平。

6.3 加强池塘管理

池塘水质的稳定对于虾类的养殖尤为重要，因此要对池塘进行严格的管理。应主要从以下几个方面加强管理：①要及时捞出病虾、死虾，防止健康虾残食；②及时清理虾的排泄物和代谢产物，避免污染水质，导致进一步的交叉污染；③可以在饲料中添加一些保肝护肠道的产品，改善虾的体质，防止寄生虫感染肠道；④虾类养殖用水在使用前，需经过蓄水池沉淀、砂滤、曝气、消毒等处理；养殖过程中产生的废水，必须要经过科学处理后，排放到指定的地点，防止扩大污染；⑤要根据实际养殖情况对池塘定期换水，必要时可向池中添加一些水质净化剂[28]。⑥降低池水盐度一定程度上可预防虾EHP的传播。

7 展望

虾类养殖集约化是未来发展大势所趋，但高密度养殖却加快了疾病的流行和传播。目前EHP 对我国虾类养殖已造成了不可估量的危害，但其生活史、与宿主之间的联系以及孢子萌发机制等问题都没有得到完全的解决。因此，在未来的研究工作中，应加强虾类养殖环境的保护与治理，加快优质虾类苗种的繁育工作，改进EHP 检测和预防技术，并尽快研制治疗EHP 的有效药物，以保障虾类养殖的健康发展。