加热时复合鱼肉蛋白性质变化研究

淡水养殖鱼类中，鲢( Hypophthalmichthys moli-trix) 产量仅次于草鱼 ( Ctenopharyngodon idellus) 位居第二，为 319. 3 万 t［1］。尽管鲢产量很大，但以鲜销为主，经济价值不高。为了提高鲢的经济价值，将鲢加工成冷冻鱼糜可以在一定程度上提高鲢的利用率，减少鲢的浪费。鱼糜制品是冷冻鱼糜或新鲜鱼肉经擂溃或斩拌、成型、加热和冷却等工序而制成的凝胶食品，是鱼类深加工中产量较大的产品，仅次于鱼类干腌制品［1］。鱼糜制品在日本、美国等发达国家的产品种 类 较 多，工 业 化 程 度 很 高。日 本 每 年 有250 万 ～ 300 万 t 鱼类用于加工鱼糜制品，其产量占各类加工品的首位。凝胶特性是衡量鱼糜制品最重要的指标。许多研究表明淡水鱼糜的凝胶特性较海水鱼糜差［3］。为了提高鲢糜的市场占有率，改善鲢糜凝胶特性成为急需解决的问题。有研究报道了鲢糜和带鱼糜以 7∶ 3 和 6∶ 4 比例复合的鱼糜在30 ℃ 和 40 ℃ 凝胶化后的凝胶特性高于两种单一鱼糜［4］。Panpipat 等［5］报道了泰国红牙 ( Otolithesruber) 和短体羽鳃鲐( Rastrelliger branchysoma) 以1∶ 1比例复合的鱼糜凝胶强度高于两种单一鱼糜。复合鱼糜成为提高淡水鱼糜凝胶强度的有效方法。肌原纤维蛋白是冷冻鱼糜中的主要蛋白，决定了鱼糜的凝胶特性［6］。肌原纤维蛋白的变性和聚集等加热特性是研究鱼糜凝胶特性的基础［7 －8］。为了更好地利用复合鱼糜提高淡水鱼糜的凝胶特性，进一步解释其中的机理，本实验研究了鲢、小黄鱼( Pseudosciaena polyactis) 及其以质量比 1∶ 1 复合的肌原纤维蛋白的加热特性，以期能够为复合鱼糜凝胶特性提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1. 1 材料

鲢和小黄鱼: 均购于北京四道口水产批发市场，鲢个体 1 000 ～1 300 g，活运至实验室; 小黄鱼个体 500 ～600 g，为冰鲜产品，置于冰盒中运回实验室。试剂: 三磷酸腺苷二钠( ATP － 2Na) 购于 Sig-ma 公司; 5，5' － 二硫双 － 2 － 硝基苯甲酸 ( DT-NB) 、三羟甲基氨基甲烷( Tris) 购于 Amresco 公司;其他化学试剂购于北京化学试剂公司。仪器设备: UNICO － 2700 分光光度计，美国尤尼克公司; GL － 16A 台式离心机，长沙平凡仪器仪表公司; 乳化分散均质机，上海弗鲁克机械制造公司; 分析天平，日本岛津公司。DK －8D 三孔电热恒温水槽，上海一恒科技有限公司。

1. 2 方法

1. 2. 1 肌原纤维蛋白的提取

敲击活鱼头部致死，去鳞、去内脏。洗净后取白肉。绞碎所得鱼肉，置于冰箱4 ℃保存。肌原纤维蛋白的提取参见潘锦锋等［9］的方法并稍做修改:取 100 g 鱼肉，加入 4 倍体积的 0. 6 mol/L NaCl －20 mmol / L Tris － maleate( pH 7. 0) 缓冲溶液。分散均质机 4 档位 15 000 r/min 匀浆 10 s。放入冰箱4 ℃ 下提取 60 min。再向蛋白提取液中加入 5 倍体积的冰冷的去离子水稀释沉淀肌原纤维蛋白。在冷冻离心机中 4 ℃，10 000 r/min 离心 20 min，取沉淀。沉淀洗涤过程重复两次。所得沉淀用 0. 6 mol/L NaCl － 20 mmol / L Tris － maleate( pH 7. 0) 缓冲液溶解，用双缩脲法测定所得肌原纤维蛋白溶液浓度，并用0. 6 mol/L NaCl －20 mmol/L Tris － maleate( pH 7. 0) 缓冲溶液调节所需蛋白浓度。

1. 2. 2 肌原纤维蛋白溶液的加热

将肌原纤维蛋白溶液调整至 2 mg/mL 或4 mg/mL。分别取 5 mL 蛋白溶液于 15 个 7 mL 的玻璃试管中，每个试管均塞上橡胶塞。将试管置于自制的泡沫板上，于温度可控的水浴锅中加热，将温度计插于试管中控制溶液温度。升温速率 1 ℃ /min。从 20 ～90 ℃每升高 5 ℃取出一根试管，放入冰水中立即冷却。

1. 2. 3 肌原纤维蛋白浊度的测定

将肌原纤维蛋白溶液调整至 2 mg/mL，加热后在 350 nm 下测定吸光值，实验重复三次取平均值。1. 2. 4 肌原纤维蛋白 Ca2 +－ ATPase 活性的测定将肌原纤维蛋白溶液调整至 4 mg/mL，加热后参考 Benjakul 等［10］的方法测定 Ca2 +－ ATPase 活性。空白组用 pH 7. 0，0. 6 mol/L NaCl －20 mmol/L Tris － maleate 缓冲液代替样品。重复 3 次取平均值。Ca2 +－ ATPase 活性的表示方法为 1 mg 酶蛋白在 1 min 内生成的无机磷酸量( μmol) 。活性 =0. 231 × ( APi +0. 0012) ; 式中 APi 为无机磷酸量( μmol) 。

1. 2. 4 肌原纤维蛋白巯基含量的测定

将肌原纤维蛋白溶液调整至 4 mg/mL，加热之后参考 Benjakul 等［10］的方法测定 Ca2 +－ ATPase 活性。空白组用 pH 7. 0，0. 6 mol/L NaCl －20 mmol/L Tris － maleate 缓冲液代替样品。重复 3 次取平均值。巯基含量用吸光度计算，用 μmol/g 蛋白表示。巯基含量计算公式为:巯基含量 = A × D/C × B其中 A 表示吸光值，B 表示待测液蛋白浓度( mg/mL) ，C 表示摩尔吸收系数，其值为 13. 6m2/ mol，D 为稀释倍数，本实验为 1。

2 结果与分析

2. 1 肌原纤维蛋白浊度的变化

由图1 可以看出，随加热温度的升高，鲢、小黄鱼及其复合肌原纤维蛋白的浊度呈 S 型增大。鲢肌原纤维蛋白和小黄鱼肌原纤维蛋白的浊度在 20～ 40 ℃ 间变化较小，当温度高于 40 ℃ 时急剧增加。而复合肌原纤维蛋白的浊度在温度高于 45 ℃时急剧增加。当温度高于 55 ℃时，鲢肌原纤维蛋白的浊度超过复合肌原纤维蛋白的浊度。当温度高于 65 ℃时，三种蛋白的浊度变化都趋于缓慢。由图 2 可见，在 40 ～ 55 ℃时，鲢肌原纤维蛋白浊度增加速率大于小黄鱼肌原纤维蛋白和复合肌原纤维蛋白的增加速率。当温度高于 45 ℃时，复合肌原纤维蛋白的浊度变化速率与小黄鱼肌原纤维蛋白的浊度变化速率基本相同。复合肌原纤维蛋白的浊度随温度的变化趋势与小黄鱼肌原纤维蛋白浊度的变化趋势相似，不同于鲢肌原纤维蛋白的变化趋势。

2. 2 肌原纤维蛋白 Ca2 +－ ATPase 活性的变化

由图3 可得，鲢和小黄鱼的酶活随着加热温度的升高逐渐降低。鲢的酶活随温度稿的降低幅度比较大。加热温度为35 ℃、40 ℃、45 ℃时，酶活为原酶活的 52. 4%，30. 2%，26. 9%，当温度高于55 ℃ 时，酶活完全丧失。在 20 ～ 30 ℃ 过程中，小黄鱼的酶活变化幅度较小。加热温度为 35 ℃、40 ℃ 、45 ℃ 时， 酶活分别为原酶活的 87. 5% ，78. 8% 和 64. 2% ，当温度高于 50 ℃ 时，酶活完全丧失。鲢和小黄鱼的比例为 1∶ 1 的复合肌原纤维蛋白的酶活随着加热温度的升高先升高后降低，在35 ℃ 时达到最大。 当加热温度上升至 40 ℃ 、45 ℃ 、50 ℃ 时， 酶活分别为原酶活的 97. 9% ，81. 8% 和 25. 7% 。从 45 ℃ 加热到 50 ℃ 时，酶活下降幅度较大，并于 55 ℃时活性完全丧失。

2. 3 肌原纤维蛋白总巯基含量的变化

由图 4 可以看出，鲢和小黄鱼以及复合肌原纤维蛋白的巯基含量随着加热温度的升高呈下降趋势。当加热温度在 30 ～ 60 ℃时，鲢和小黄鱼的巯基含量下降缓慢，当温度高于 60 ℃时巯基含量显著下降。复合肌原纤维蛋白的巯基含量在 30 ～65 ℃ 时下降缓慢，当温度高于 65 ℃ 时显著下降。与浊度和 Ca2 +－ ATPase 活性变化相比，巯基含量随温度的变化幅度较小。但巯基含量的变化对蛋白的聚集有着非常重要的作用。

3 讨论

蛋白 浊 度 的 变 化 表 征 蛋 白 聚 集 的 行 为。Haihong 等［11］报道了正常猪肉的肌原纤维蛋白浊度在加热温度高于70 ℃时有下降的趋势。Yongsawat-digul 等［12］也报道了大西洋鳕( Gadus morhua) 的肌原纤维蛋白在加热温度高于 50 ℃时浊度降低。这可能是蛋白酶水解蛋白大分子，导致蛋白大分子解体所致。鲢肌原纤维蛋白、小黄鱼肌原纤维蛋白和复合肌原纤维蛋白的浊度并无此现象。据文献报道，较快的蛋白变性速度以及较慢的蛋白聚集速度有利于形成较好的凝胶结构，有利于凝胶强度的提高［13］。加热温度在 40 ～55 ℃时，鲢肌原纤维蛋白的浊度变化速率较大即聚集速率较大，这可能是鲢糜凝胶强度较低的一个原因; 同时小黄鱼和鲢以1∶ 1复合的肌原纤维蛋白的浊度变化速率较小，而且变化模式和小黄鱼肌原纤维蛋白的浊度变化模式相似，即与小黄鱼的蛋白聚集模式相似，这可能导致了淡水鱼糜和海水鱼糜的复合鱼糜凝胶强度高于淡水鱼糜的凝胶强度。潘锦峰等［9］报道的草鱼肌原纤维蛋白的酶活在36 ～42 ℃过程中略有上升，当温度高于42 ℃时迅速下降。Thazhakot 等［14］在考察南亚野鲮( Labeorohita) 、喀拉鲃( Catla calta) 和印鲮( Cirrhinus mri-gala) 的肌原纤维蛋白热稳定性时报道，酶活在 10～ 40 ℃ 时基本不变。姚磊等［15］报道的鲫肌原纤维蛋白的酶活在 20 ～28 ℃基本不变，28 ～34 ℃缓慢下降。肌原纤维蛋白的 Ca2 +－ ATPase 活性源于肌球蛋白头部结构，可以表示蛋白的变性程度。在20 ～ 35 ℃ 时鲢肌原纤维蛋白的酶活比鲫，喀拉鲃、南亚野鲮和印鲮 4 种鱼的肌原纤维蛋白酶活的下降程度大，即鲢的肌球蛋白头部在 20 ～ 35 ℃时变性较大。小黄鱼肌原纤维蛋白酶活在20 ～30 ℃ 时变化较小。复合肌原纤维蛋白在 20 ～ 35 ℃时，酶活略有上升，与鲢肌原纤维蛋白和小黄鱼肌原纤维蛋白的酶活变化不同。复合肌原纤维蛋白的酶活随着加热温度的升高先上升后降低，这可能是因为两种肌原纤维蛋白聚集或变化引起的暂时性酶活上升所致。对两种蛋白在加热过程中的相互作用还应进行更加深入的研究。Wen － Ching 等［16］报道了罗非鱼的总巯基含量在 25 ～45 ℃时变化不大，但在55 ～66 ℃时总巯基含量下降，这是由于分子内部二硫键形成所致。当加热温度达到 75 ℃时，总巯基含量下降，同时有大于肌球蛋白重链的分子形成，说明分子间的二硫键形成。在加热温度高于 65 ℃时，复合肌原纤维蛋白的总巯基含量下降迅速，这可能是形成了分子间二硫键。