抗冻多肽对冷冻鱼糜的品质调控：从宏观到微观

福州大学化学学院、福州大学生物与科学工程学院、农业农村部冷冻调理水产品加工重点实验室（厦门）的Yang Fujia等从鱼糜的宏观水分变化和蛋白质溶解度到微观的肌纤维蛋白变性和结构变化，详细阐述暗纹东方鲀（Takifugu obscurus）鱼皮抗冻肽（antifreeze peptides from Takifugu obscurus skins，TsAFP）对冻融循环冷冻损伤草鱼（Ctenopharyngodon idella）鱼糜的冷冻保护作用。同时，采用分子对接技术分析抗冻肽对蛋白质保护的深层机制。Introduction鱼糜制品是一种高蛋白、低脂的健康食品，深受世界各地消费者的欢迎。然而，由于鱼糜的高水分活性以及贮藏期间肌原纤维蛋白的易变性，生鱼糜的品质难以保持。冷冻技术是目前流通和销售过程中最常用的肌肉制品贮藏方法，其通过抑制生物体的代谢活动延长货架期。然而，由于冷链技术的限制，在运输或零售环境中不可避免地发生反复冻融。许多研究表明，冷冻过程中的温度波动会导致冷冻肌肉制品中冰晶的形成和重结晶，并破坏肌肉组织，导致蛋白质结构被破坏和功能性质的损失，这直接影响产品的质量。冷冻保护剂可以保护冷冻食品免受冷冻过程中冰晶引起的机械损伤。4%蔗糖和4%山梨糖醇是最常用于鱼糜制品的冷冻保护剂，但二者会产生甜味，并因摄入过多热量而不利于健康。防冻肽是一种蛋白质片段，其可以以非依数形式降低溶液的冰点，并抑制冰晶的生长和重结晶，以防止冷冻损伤。丰富的原料和可控的生产工艺为抗冻肽的工业化生产和应用提供了保障。此外，抗冻肽具有稳定的物理和化学性质。冰晶引起的蛋白质冷冻变性是鱼糜在流通和贮藏过程中质量恶化的主要原因。因此，抗冻肽可以通过抑制重结晶保持鱼糜的品质特性并减少冻融循环期间的滴水损失。然而，关于抗冻肽对冷冻鱼糜的影响及其机制的研究较少。Result and analysisTsAFP对冰晶重结晶抑制活性的表征TsAFP的冰晶重结晶抑制活性如图1所示。在没有TsAFP的溶液中形成的冰晶形状不规则，随着时间的延长，小冰晶聚集形成更大的冰晶，而在含有TsAFP的液体中形成的冰晶相对较小且形状规则。这些结果表明，TsAFP可以显著抑制冰晶生长和重结晶，并为TsAFP对鱼糜的冷冻保护作用提供了可能。

比例尺100 μm；红色箭头指向冰晶。

图1 抑制冰再结晶的光学显微镜图像

TsAFP对鱼糜水分变化和蛋白盐溶解度的影响为探讨TsAFP对冷冻鱼糜的保护作用，测定冻融循环过程中鱼糜的水分变化和蛋白质盐溶解度，从而直观地判断冷冻鱼糜质量的变化。如图2A和2B所示，随着冻融循环次数的增加，冷冻鱼糜的解冻损失和离心损失逐渐增加。在3 次冻融循环后，所有处理组（阳性对照组和4 个TsAFP处理组）的解冻和离心损失率显著低于阴性对照组（P<0.05）。2% TsAFP处理对鱼糜具有显著的抗冻效果，4% TsAFP处理鱼糜与阳性对照组相似，表明TsAFP能够在反复冻融循环过程中抑制水分流失，具有抑制冰晶生长的能力，从而提高了冷冻鱼糜的保水力。

图2 冻融循环后草鱼鱼糜的水分变化（A）和盐溶性蛋白质含量（B）

鱼糜中盐溶性蛋白含量如图2C所示。随着冻融周期的延长，鱼糜中盐溶性蛋白含量呈下降趋势，表明鱼糜中的蛋白构象发生变化，盐溶性受到影响。阴性对照组的盐溶性蛋白含量在1 次冷冻-解冻循环后从（85.30±0.77）%急剧下降到（54.11±6.68）%，而处理组（阳性对照组和4 个TsAFP处理组）可以抑制盐溶性蛋白含量的下降。此外，添加4% TsAFP与使用商业冷冻保护剂（8% 蔗糖/山梨醇）的冷冻保护效果相当。这些结果表明，TsAFP可以抑制疏水性芳香族氨基酸的暴露，从而通过疏水相互作用防止蛋白聚集，提高蛋白的溶解度。肌原纤维蛋白冷冻变性和氧化的变化总巯基含量和二硫键含量肌原纤维蛋白中总巯基含量和二硫键含量的变化如图3A和3B所示。随着冻融次数的增加，各组总巯基含量均降低，二硫键含量均增加。巯基含量的减少可能是由于肌原纤维蛋白的冷冻变性，使巯基暴露发生半胱氨酸-巯基氧化或二硫键交换反应，从而导致二硫键含量增加。结果表明，在没有冷冻保护剂的情况下，巯基含量在5 次冷冻-解冻循环后下降最大，4%抗冻肽对巯基氧化的抑制作用接近8%蔗糖/山梨醇商用冷冻保护剂。这可以解释为TsAFP可以抑制冰晶的生长，并保护肌原纤维蛋白结构在冷冻或冻融循环期间免受损害，从而抑制巯基的冷冻氧化以生成二硫键。

（A） 总巯基含量；（B） 二硫键含量；（C） Ca2＋-ATP酶活性；（D） 表面疏水性；（E） 羰基含量。

图3 草鱼肌原纤维蛋白冷冻变性和氧化的变化

Ca2＋-ATPase活性Ca2＋-ATPase活性是反映冷冻贮藏时肌球蛋白分子结构完整性的敏感指标，对整个肌原纤维蛋白的稳定性有重要影响。在冻融循环后，在没有冷冻保护剂的情况下，肌原纤维蛋白的Ca2＋-ATPase活性最低，且降低程度最大（图3C）。在1 次冻融循环后，对照组的Ca2＋-ATPase活性降低了29.03%，这可能是由于冰晶的形成和肌球蛋白头部区域变性所致。与阴性对照相比，8%蔗糖/山梨醇和不同浓度TsAFP处理的肌原纤维蛋白的Ca2＋-ATPase活性下降缓慢。此外，在5 次冻融循环后，8% TsAFP组的Ca2＋-ATPase活性最高。据推测，含有高比例亲水性氨基酸的TsAFP倾向于与水分子结合，阻碍冰晶生长并减少肌原纤维蛋白变性，从而有助于保持Ca2＋-ATPase活性。表面疏水性如图3D所示，在1 次冷冻融循环后各组与新鲜鱼糜之间溴酚蓝结合量无显著差异。然而，对照组在2 次冻融循环后开始显著增加。随着冻融周期的增加，处理组（阳性对照和4 个TsAFP处理组）的溴酚蓝结合量也缓慢增加。4 次冻融循环后，处理组（阳性对照组和4 个TsAFP处理组）和新鲜鱼糜差异显著。添加4% TsAFP鱼糜表面疏水性的增加被明显抑制，并与添加8%蔗糖和山梨醇的阳性对照组相似，而未添加冷冻保护剂的鱼糜具有最高的表面疏水性（P<0.05）。这表明肌原纤维蛋白的构象变化导致疏水结构域的暴露。羰基含量羰基含量是衡量蛋白质氧化程度的常用指标。如图3E所示，在1 次冷冻-解冻循环后，阴性对照组中肌原纤维蛋白的羰基含量从（0.21±0.06）mg/mL增加到（0.72±0.08）mg/mL，而在5 次冷冻-融化循环后，阳性对照组的羰基含量增加到新鲜鱼糜的10.29 倍。随着TsAFP添加量的增加，肌原纤维蛋白的羰基含量明显降低，说明肌原纤维蛋白的氧化被显著抑制，甚至优于商业冷冻保护剂。羰基主要由氨基酸侧链的直接氧化、与还原糖的非酶羰基化反应、与非蛋白质糖基化化合物的结合以及多肽链的氧化裂解产生。结果表明，TsAFP不仅能有效抑制冰晶的生长，还能有效地防止冷冻变性和抑制蛋白质的氧化。草鱼肌原纤维蛋白构象的变化拉曼光谱分析图4显示了经过不同冻融循环的肌原纤维蛋白溶液的拉曼光谱。酰胺I带的特征峰（1 600~1 700 cm－1）可用于分析蛋白质的二级结构，主要包括C—O拉伸振动、C—N拉伸振动、C—C—N弯曲振动和N—H平面弯曲振动。阴性对照的峰强度随着冻融周期的增加而降低，1 250～1 500 cm－1和2 800 cm－1附近的部分峰消失。研究表明，位于1 300 cm－1处的峰与肌球蛋白的α-螺旋结构有关。冷冻变性、巯基氧化和水-蛋白质分子间氢键的变化导致蛋白质的二级结构和空间构象被破坏，导致峰的位置改变或消失。2 900 cm－1处的强峰归属于芳香族氨基酸、肽和蛋白质的C—H拉伸振动，其峰强度的变化与羟基链在极性环境中的暴露有关。对照组中的峰消失可能是由于肌纤维蛋白在冻融循环期间冷冻变性，导致蛋白质构象变化和肽链展开，促进了芳香族氨基酸侧链的暴露。而处理组（阳性对照和4 个TsAFP处理组）的拉曼光谱没有明显变化。

（A）对照；（B） 2% TsAFP；（C） 4% TsAFP；（D） 6% TsAFP；（E） 8% TsAFP；（F） 8%蔗糖/山梨醇。

图4 拉曼光谱（400~3 600cm－1） 草鱼肌原纤维蛋白

如图5所示，随着冻融周期的增加，阴性对照组中无规卷曲相对含量从27.80%逐渐增加到31.54%，同时α-螺旋相对含量减少，表明在冻融循环期间，不含TsAFP的肌原纤维蛋白的二级结构从有序变为无序。在冻融循环期间，由于严重的温度波动，维持α-螺旋结构稳定的氢键逐渐被破坏，肌原纤维蛋白的α-螺旋结构解螺旋。肌球蛋白尾部的α-螺旋中存在大量疏水基团，这些疏水基团由于蛋白质冷冻变性而暴露。这与上述表面疏水性结果一致。处理组中蛋白质的二级结构没有显著变化，表明在冻融过程中TsAFP对草鱼肌原纤维蛋白质具有良好的保护作用，可以有效地保持蛋白质二级结构的稳定。

图5 草鱼肌原纤维蛋白拉曼光谱的二级结构变化

荧光光谱（300～450 nm）分析如图6所示，蛋白质冷冻变性程度随着冻融周期的增加而增加，这可能会导致色氨酸残基荧光猝灭，荧光强度降低，特别是阴性对照组。而冷冻保护剂的添加减少了冷冻和解冻过程中肌原纤维蛋白的变性和氧化。在5 次冻融循环后，4% TsAFP组和8%蔗糖和山梨醇组具有相似的荧光强度，表明4% TsAFP和商业冷冻保护剂具有相似的冷冻保护作用。随着冻融周期的增加，阴性对照组的荧光光谱出现蓝移，表明冻融周期使色氨酸残基周围微环境的极性减弱。色氨酸稳态的变化可能是由于冻融循环氧化过程中蛋白质展开暴露出疏水性氨基酸。疏水基团的暴露也导致蛋白质聚集体的形成，这与与盐溶性蛋白质含量的结果互相印证，表明TsAFP的添加可以抑制蛋白质三级结构稳定性的降低。

图6 草鱼肌纤维蛋白质在5 次冻融循环前（A）、后（B）的荧光光谱（300~450 nm）

抗冻肽与肌球蛋白的分子对接分析选择草鱼肌球蛋白进行同源性建模和分子对接（图7）。根据Ramachandran Plot的结果，在由SWISS-model构建的3D模型中，91.9%的氨基酸残基落在扭转角区的核心区域，7.6%落在允许区，0.4%落在最大允许区，0.1%落在不允许区中，99.9%落在合理区范围内。通过VERIFY 3D验证晶体结构得分情况，87.50%的残基的平均得分大于或等于0.2。3D结构模型的准确值为94.881%，表明肌球蛋白同源性模型适用于后续的分子对接研究。

（A） 肌球蛋白模型结果；（B） Ramachandran Plot；（C） VERIFY 3D；（D）ERRAT。

图7 肌球蛋白建模结果评估

结合之前对TsAFP纯化的研究，发现TsAFP的高抗冻活性肽片段可以与冰晶结合以发挥抗冻活性。此外，抗冻肽片段GG-13和GG-10（以下以GG-13（10）表示）不仅可以与冰晶结合，还可以直接与肌球蛋白结合（图8），在鱼糜的冷冻保护中发挥了重要作用。羰基的形成是由碱性氨基酸如Lys和His的氧化引起的。分子对接结果表明，肌球蛋白中的Lys和His可以与GG-13（10）形成盐桥和碳氢键，在这些作用力下Lys的氧化速率减慢。这也可能是羰基含量增加减缓的原因。冻融循环期间表面疏水性的增加可能是由于蛋白质折叠以及脂肪和芳香族氨基酸的暴露。GG-13（10）与脂肪族侧链氨基酸Ile、Leu、Val形成烷基，并通过范德华力与芳香族氨基酸Phe相互作用。这些相互作用影响了芳香族氨基酸侧链的暴露和肌球蛋白的折叠能力，从而抑制了疏水性的增加。

（A） 、（B）模拟GG-13与肌球蛋白的结合和详细相互作用；（C） 、（D）模拟GG-10与肌球蛋白的结合和详细相互作用。

图8 GG-13和GG-10与肌球蛋白的对接结果

此外，GG-13（10）与肌球蛋白之间形成了大量氢键和碳氢键，GG-13（10）也通过范德华力与肌球蛋白相互作用。这些作用力在维持肌球蛋白的空间结构和持水力方面发挥重要作用。此外，抗冻肽能够结合在肌球蛋白中游离水凝结形成的冰晶上，这可能是TsAFP抑制巯基转化为二硫键并增强Ca2＋-ATPase活性的原因。在冷冻贮藏期间结合水冻结并与蛋白解离，而GG-13（10）可以通过分子间作用力与肌球蛋白的空腔结构结合，从而影响结合水与蛋白质的解离，并保持鱼糜的质量。Conclusions

在这项研究中，通过在宏观水平上测定鱼糜的水分变化和蛋白质溶解度，以及在微观水平上测定肌原纤维蛋白的变性和结构变化，阐述了TsAFP对冻融循环损伤鱼糜的冷冻保护作用。结果表明，4%的TsAFP对鱼糜具有良好的冷冻保护作用。同时，利用分子对接技术进一步探讨了抗冻肽对蛋白质的保护机制。结果表明，TsAFP不仅可以通过抑制冰晶的生长和重结晶防止蛋白质的冷冻变性，还可以通过直接结合肌球蛋白的结构腔维持蛋白质的空间结构和保水能力，从而抑制冷冻诱导的蛋白氧化和变质，以保持鱼糜的质量。该研究有望加深对抗冻肽预防鱼糜中冰晶损伤机理的理解，为冷冻食品提供有效的抗冻保护剂。